Bitki Islahında Doku Kültürlerinden Faydalanma

12 Temmuz 2007



BİTKİ ISLAHINDA DOKU KÜLTÜRLERİNDEN FAYDALANMA

GİRİŞ

Tüm besin zincirlerinde primer üretici olarak yer alan ve hayvanlar için yegane yenilebilir enerji kaynağı olan bitkiler yer yüzündeki yaşamın kaynağını oluştururlar. İnsanlar tarafında tüketilen enerjinin %90’ı, proteinin ise %80’i bitkisel kaynaklıdır. Geriye kalan enerji ve proteinin gereksinimi ise hayvansal ürünlerden karşılanır.

II.Dünya savaşından beri gelişen endüstrileşme, ekonomik ve sosyal refah, yetiştirilen sağlık tedbirleri dünya nüfusunun tehlikeli bir şekilde çoğalmasına yardım etmekte ve nüfus patlaması denilen bir olaya sebep olmaktadır. Dünya nüfusu arttıkça, dünya tarımının besleyebileceği insan nüfusu üzerindeki tartışmalar da yoğunlaşmaktadır. Bazı araştırmacılara göre ; günümüzde insan nüfusu dünya tarımının besleyebileceği limiti aşmış durumdadır. Dünyanın birçok bölgesinde her yıl açlık ve yetersiz beslenme nedeniyle binlerce insan ölmektedir. İnsanoğlunun yeterli ve dengeli bir şekilde beslenerek yeryüzündeki varlığını devam ettirebilmesi için; nüfus artış hızının kontrol edilmesi ve besin maddeleri üretiminin artırılması gerekmektedir. Besin maddeleri içerisinde özellikle bitkisel besin maddeleri üretiminin artırılması büyük önem taşımaktadır. Bitkisel üretimin artırılması, üretim alanlarının artırılması veya birim alanda elde edilen verimin artırılmasıyla mümkündür.

Öncelikle üretim alanlarının artırılmasını göz önüne alalım. Yeryüzünde karaların kapladığı alanlar 14 milyar hektardır. Halen bu karasal alanın %10’un da bitkisel üretim yapılmaktadır. Dünya karalarının %20’sini meralar, %20’sini dağlar, %20’sini buzullar, %20’sini ise çöller kaplamaktadır. Geriye kalan %10’luk alan ise çok yüzeysel bir toprak örtüsüne sahiptir. Dağlar ve buzullarla kaplı alanda tarım yapımının olanaksız olduğu göz önüne alındığında, geriye potansiyel tarım alanı olarak meralar, çöller veya yetersiz toprak örtüsüne sahip alanlar kalmaktadır. Genellikle engebeli ve çok eğimli alanları kaplayan meraların tarla arazisi olarak kullanılması büyük ölçüde olanaksızdır. Çöllerin ve yetersiz toprak örtüsüne sahip olan alanların tarıma uygun duruma getirilmesi ise büyük yatırım gerektirir. Ancak her yıl artan nüfusa paralel olarak tarım alanlarının artan bir şekilde tarım dışı amaçlarla kullanılması ( iskan, yol, fabrika yapımında kullanılması) dikkate alındığında, tarıma yine açılacak alanlarla bitkisel üretimin artırılamayacağı ortaya çıkmaktadır.

İkinci ise birim alandan alınacak verimin artırılması, yani potansiyel verimi artırmak bunun içinde bitkilerin genetik yapılarının ve çevrelerinin daha iyi bir şekilde kombine edilmesi gerekir. Son yüz yılda bitkilerin çevrelerinin iyileştirilmesi amacıyla uygulanan gübreleme, sulama, hastalık ve zararlılarla mücadele için kullanılan kimyasalların veriminde büyük artışlar sağlanmasına karşılık , bu uygulamaların özellikle bilinçsiz bir şekilde yapılmasının uzun dönemde yeryüzündeki ekolojik dengeyi olumsuz önde etkilediği ortaya çıkmıştır. Örneğin uygulanan aşırı dozdaki azotlu gübrelerin toprakta yıkanarak içme sularını ve denizleri kirlettiği, gaz halinde topraktan uzaklaşan azot bileşenlerinin yeryüzünü zararlı ışınlardan koruyan ozon tabakasını olumsuz yönde etkilediği saptanmıştır. Diğer taraftan, yabancı ot ve zararlılarla mücadele amacıyla uygulanan herbisit ve insektisitlerin tarım alanlarında doğal dengeyi bozarak, yeni yeni hastalık ve zararlıların ortaya çıkmasına neden oldu. Bu, kalıcı etkisi olan bazı kimyasalların bitki bünyesinde biriktiği ve bu bitkilerle beslenen insanların sağlığının olumsuz yönde etkilendiği anlaşılmıştır.

Sonuç olarak gelecekte daha fazla gübre daha fazla herbisit ve insektisit kullanarak verimini artırması söz konusu değildir. Bu durumda bitkisel üretimde verim artışlarının daha çok bitkilerin genetik yapılarının ıslahı ve kullanılan girdilerin daha bilinçli bir şekilde uygulanması ile sağlanabileceği ortaya çıkmaktadır.

Bugün bitki ıslahının tarım üretimin artırmasındaki payı ve önemi tartışılmaz bir durumdadır. Geleneksel ıslah yöntemleri bitkisel üretimin artırılmasında oldukça başarılı olmasına rağmen doğası gereği yavaş ve zaman alıcıdır. Ayrıca, bu yöntemlerde doğadaki dar sınırlar içerisinde bulunan varıyabiliteden faydalanmak esasdır. Bugün hepsinde olmasa da özellikle insanlar için yaşamsal öneme sahip tahıllarda sorunların çözümü için genetik varıyabilitinin sınırlarına yaklaşılmış veya söz konusu bu genetik varıyabilite tüketilmek üzeredir.

Bunun için önemli kültür bitkilerin ıslahında kullanılacak daha geniş bir genetik varıyabiliteyi tahmin etmek zorunludur. Bu ise taksonomik genetik olarak farklı türler arasındaki eşeysel uyuşmazlık engellerinin aşılması mutasyonlar DNA formundaki genetik materyalin transferi habloid hücreler ve bitkilerin ede edilmesi protoplast kaynaşması veya somatik melezlemeler ile mümkündür. İşte bitki doku kültürleri belirtilen bu hususlarda büyük bir potansiyele sahiptir. Bitki doku kültürleri genel bir tabir olup bitkilerin doku, organik hücre yada hücre kısımlarının bitkilerden ayrılarak ( izole edilerek) kapalı ve cam kaplarda “İN VİTRO” yapay besin ortamında ve steril koşullarda yetiştirilerek bütün organları tam bitkilerin elde edilmesi işlemidir. Bugün doku kültürlerden elde edilen sonuçlar laboratuar dışına çıkarak pratikte ve ticarette kullanım alanı bulmuş olup, gelişen tekniklerle her geçen gün daha da önem kazanmaktadır.

Bitki doku kültürü tekniklerinden başta bitki ıslahı ve genetik çalışmalar olmak üzere fizyolojik, biyokimyasal ve biyolojik olayların incelenmesinde klasik yöntemlerle deneylerin gerçekleştirilmesinde değerli genotiplerin ve tohumların ile çoğalması güç olan orkide, karanfil ve sardunya gibi birçok bitkinin ticari anlamda yetiştirilmesi alkoloid ve steroid gibi çeşitli bitkisel metaloplitlerin üretilmesinde ve diğer bir çok alanda yararlanılmaktadır.

Bitki ıslahı maksadıyla ; haploid bitkiler türler arası melezlerden meydana getirilerek elde edilmesi yaşatılması. Eşeysel melezlerle başarılamayan melezlerin somatik olarak gerçekleştirilmesi,doğal olarak mevcut kendine kısırlık ve uyuşmazlık engellerinin ortadan kaldırılması ve mutasyon çalışmalarında klasik ıslah yöntemleri kombine edilerek ıslah süresinin kısaltılmasında kolaylaştırılmasında ve başlangıç materyalinin elde edilmesinde kullanılmaktadır.

DOKU KÜLTÜRÜNÜN TARİHSEL GELİŞİMİ

Bitki biyo teknolojisinin temelleri 1838 yılında Schwann ve Schleiden’ıntotipatens teorisi ile atılmıştır. Bu teoriye göre, hücrelerin otonom üniteler oldukları ve tek bir hücreden tem teşekküllü bir bitki gelişebileceği iddia ediyordu. Ancak, bu teori başlangıçta çok fazla kabul görmedi. Çünkü ; yapılan laboratuar araştırmalarında tekbir hücreden tam teşekküllü bir bitki rejenerasyonu gerçekleştirilememiştir.

1902 yılında Alman bilim adamı Haberland, bitki dokularını yapay besi ortamlarında kültüre etmeyi denedi. Ancak, bu deneme başarısızlıkla sonuçlandı.

1921 yılında Molliard, bitki embriyolarını yapay besi ortamlarında sınırlı ölçüde geliştirmeyi başardı.

1922 yılında Robbins ve Kotte, birbirinden bağımsız olarak bitki kök ve uçlarını inorganik tuz ve glikoz içeren sıvı bir besi ortamında kültüre almışlar ve kök parçalarının kısa bir sürede iyi bir şekilde geliştiğini saptamışlardır. Bu öncü çalışmada, kültürde başarılı sonuç almanın mikroorganizma bulaşmasına engel olunarak sağlanabileceği, diğer bir deyişle steril koşullarda yapılan kültürlerde iyi sonuç alınabileceği saptanmıştır.

1925 yılında Laibachı Linum türleri arasındaki melezlemelerden elde edilen embriyoları yapay besi ortamlarında kültüre etmeyi başarmıştır. Laibach’ın başarısı in vitra kültürden pratiğe aktarılan en önemli başarılı sonuçlardan birisi idi. Çünkü bu melezlemelerde oluşan melez embriyolarının bitkide kalması durumunda normal gelişmelerini tamamlamaları mümkün değildi.

1934 yılında White; şeker, inorganik tuz ve bira mayası bulunan besi ortamında kültüre aldığı domates kök uçlarının aktif bir şekilde geliştiği saptanmıştır. Aynı yılda Gautharef aseptik koşullarda bazı ağaç ve çalı türlerinin kambiyum dokularını sınırlı ölçüde kkültüre etmeyi başarmıştır.

1939 yılında Nobecourt, sürekli büyüme gösteren organize olmamış doku ( Kallos) kültürlerini elde etmeyi başarmıştır. 1941 yılında Overbeck, ilk defa hindistan cevizi sütü içeren besi ortamında Datura embriyolarının galişmesini sağlamıştır. Bu araştırma ile hindistan cevizi sütünün hücre bölünmesinin uyaran kimyasallar içerdiği saptanmıştır.

1946 yılında Ball, ilk defa sürgün uçlarının in vitra kültüründen tam teşekküllü lüpen (Lupinus) ve Latin çiçeği (Trapaeolum) bitkilerinin rejenerasyonunu gerçekleştirmiştir.

1952 yılında Morel ve Martin, meristem kültürü yoluyla ilk virusten arındırılmış Dahlia bitkilerini elde ettiler.

1953 yılında Tulecke, Japon eriği (ginko biloba?) bitkisi polenlerini yapay besi ortamında kültüre alarak ilk defa haploid kallus elde etmeyi başarmıştır.

1954 yılında Strauss, mısır endosperm kültürlerinde karyolojik ve kromozom düzensizlikleri olduğunu gözlemiştir. Aynı yıl muir ve arkadaşları ilk defa yapay besi ortamında tek hücreden tam teşekküllü bir bitki elde etmeyi başarmışlardır.

1955 yılında miller ve arkadaşları, hücre bölünmesini uyaran bir hormon olan kinetini keşfetmişlerdir.

1956 yılında Tulecke ve Nickeli sekonder bitki metabolitlerini elde etmek üzere hücre ve süspensiyon kültürlerini elde etmeyi başarmışlardır.

1957 yılında Skoog ve Miller, bitkilerde organ oluşumunun sitokinin/oksin oranına bağlı olduğunu saptamışlardır.

1958 yılında Reiner ve Stewart, havuç kallus ve hücre kültürlerinde somatik embriyoların oluşumunu saptamışlardır.

1959 yılında iki doku kültürleri ile ilgili ilk bilimsel eser Gautheret tarafından yayınlanmıştır.

1960 yılında Kanta, ilk defa gelincik (papaver rhoeas) bitkisinde test tüpü döllenmesini gerçekleştirmiştir.

1960 yılında cooking, hücre duvarlarını enzimlerle parçarak protoplast elde etmeyi başarmıştır.

1962 yılında Murashiye ve Skoong , günümüzde de en fazla kullanılan besi ortamı olan yapay bitki besi ortamını geliştirmişlerdir.

1964 yılında Guha ve Muhesveri, Datura bitkisinin anterlerinin yapay besi ortamında kültürü yoluyla ilk habloid bitkileri elde etmişlerdir.

1967 yılında Bougin ve Nitsch, tütünde anter kültürü yoluyla ilk habloid bitkileri elde etmişlerdir.

1969 yılında Erikson ve Jonassen, Hapopappus gracilis bitkisinde süspansiyon kültürlerinden ilk defa başarılı bir şekilde protoplast izolasyonunu gerçekleştirmişlerdir.

1970 yılında Kasha ve Kao, kültür arpası(Hardeum vulgare) ile yumrulu arpanın (H.bulbosum) melezlenmesi sonucu oluşan embriyoları yapay besi ortamında kültüre alarak ilk materyal haploid bitkileri elde etmişlerdir.

1971 yılında Takebe ve arkadaşları, ilk defa bitki protoplastlarından bitki rejenerasyonunu gerçekleştirmişlerdir.

1972 yılında Carlson ve arkadaşları, farklı tütün türlerinin protoplastlarını birleştirerek ilk somatik melezlemeyi gerçekleştirmişlerdir.

1974 yılında zaenen ve arkadaşları, özellikle geniş yapraklı bitkilerde tümör oluşumuna neden olan Agrobacterium’un bu tümör oluşumunu Ti-plasmidi aracılığıyla gerçekleştirdiğini saptamışlardır.

1975 yılında Gengenbach ve Grean , mısır kallus kültürlerinde Idelmindhosporium maydis’e karşı dayanıklılık yönünden seleksiyon yapmışlardır.

1976 yılında Seibert, uzun süre dondurulmuş halde korunan karanfil sürgün uçlarından sürgün elde etmeyi başarmıştır.

1977 yılında Chilton ve arkadaşları Agrobacterium tümefaciens’ten Ti-plazmid DNA’sını bitkilere aktarmayı başarmışlardır.

1978 yılında Melehers ve arkadaşları , domates ve patates bitkilerinin protoplastlarını birleştirerek , ilk defa cinsler arası somatik melezleri elde etmişlerdir.

1982 yılında Zimmermann elektirik şokundan yararlanarak , protoplast füzyonunu gerçekleştirdi.

1985 yılında Horsch ve arkadaşları yaprak disklerini Agrobacterium tümefaciens ile enfekte ederek , Ti-plazmid DNA’sını aktarmayı ve bu yapraklardan transgenik bitkileri elde etmeyi başardılar.

Bitki Hücre ve Doku Kültürlerinin Beslenmesi ve Besi Ortamı

Bir bitkinin in vitro büyümesi ve gelişmesi aşağıdaki faktörler tarafından belirlenir:

Bitkinin genetik yapısı

Besin maddeleri: Su, Makro ve mikro besin elementleri ,şeker

Fiziksel büyüme faktörleri: Işık , sıcaklık, PH , O2 ve CO2 konsantrasyonları

Bazı orgonik maddeler : büyüme regülatöleri , vitaminler vs.

Bitkinin genetik yapısı, bitki büyüme ve gelişmesini her aşamasında belirleyici faktördür. Örneğin; bitki büyüme ve gelişmesi için hangi sıcaklığın optimum olduğu bitkinin genetik yapısına bağlıdır. Diğer taraftan bitkideki genetik faktörlerin etkinlik derecesi ise bitki çevresinde bulunan fiziksel ve kimyasal faktörlere bağlıdır.

Su ve minerallerin maddeleri olmaksızın bir bitkinin in vitro veya in vivo yaşayabilmesi mümkün değildir. Ayrıca, in vitro kültürde bitki hücre ve dokuları tam anlamıyla ototrojik olmadıklarından kültür ortamında şekerede gereksinim duyarlar.

Fiziksel faktörlerin in vitro kültürde bitki büyüme ve gelişmesine etkisi in vivo koşullarındaki etkilerine benzer. Bu faktörler bitkide cereyan eden su alımı, evaporasyon, fotosentez, solunum, büyüme, çiçeklenme, meyve bağlama gibi olayların tümünü etkilerler.

Bitkinin çok düşük konsantrasyonlarda gereksinim duyduğu büyüme regülatörleri ise, bitkinin büyüme ve gelişmesini düzenleyen organik maddelerdir. Oksin ve sitokinin gibi büyüme regülatörleri in vitro kültürde kültüre alınan bitki parçalarından organ oluşumunu düzenlerler.

Yukarıdaki açıklamalardan in vitro kültürde bitki hücre , doku ve organlarının büyüme ve gelişmelerinin düzenlenmesinin karışık bir olay olduğu anlaşılmaktadır. Farklı bitki cins ve türlerine ait hücre, doku ve organların gelişmesini sağlayabilecek tek bir gıda ortamı yoktur. Bir bitki türünün farklı eksplantpatları için en uygun ortam ancak araştırmalarla saptanabilir. Bazen , bir bitki materyalinin kültüründe başarıyı besi ortamının sıvı olması veya katı olması da etkileyebilir.

İn vitro koşullarda izole edilen , büyüme ve gelişmeye teşvik edilen bir bitki eksplantatı (doku, organ, hücre) bir çok maddelere gereksinim duyar.

Bitki Organ Ve Doku Kültürlerinin Besin Maddesi Ve Hormon İhtiyaçları

Şekilden de görüldüğü gibi bitki eksplantatlarının in vitro kültürde gereksinim duydukları maddelerin bir kısmı (su, makro ve mikro besin elementleri) bitkilerini normal in vivo gelişmelerinde de gereklidir. Buna karşılık, in vitro kültürde gereksinim duyulan organik maddeler ve farklı madde karışımlarına bitki normal doğal yaşam ortamında gerek duymaz. Bu maddeleri kendisi sentezler. Yani in vitro kültür heterotrofiktir. Normal olarak in vitro kültürde su, makro ve mikro elementleri şeker ve iki grup büyüme regslatörüne (oksinler ve sitokininler) gereksinim duyulur. Eğer bu komponentlerden birisi eksikse kültür edilen bitki hücre doku ve organlarında büyüme ve gelişme olmaz. Ve izole edilmiş olan doku veya organ in vitro kültürde örneğin oksine gereksinim duymuyorsa söz konusu kültür oksin otorof olarak adlandırılır. Bazı durumlarda da besi ortamına kompleks bileşikler ilave edilir. Bu tip maddelerin ilavesi genellikle söz konusu kültürün besin maddesi ve hormon ihtiyacının tam olarak bilinmediği durumlarda söz konusudur.

Bugüne kadar kullanılan besi ortamları birçok sentetik maddelerin karışımından oluşmaktadır. Belirli bir bitki türünün belirli bir eksplantatı için dengeli bir besi ortamının ortaya konması çok uzun bir zaman ve iş gücünü gerektirir. Eğer besi ortamı 20 farklı maddeden oluşacaksa, bunların en uygun bir şekilde kombine edilmesi araştırmalarla saptanır. Birçok besi ortamı mevcuttur. Bilinen bu besi ortamları ele alınan bitki türüne ait eksplantat için uygun besi ortamının hazırlanmasında yardımcı olabilir.

MERİSTEM KÜLTÜRÜ ve VİRÜSSÜZ BİTKİ ELDE EDİLMESİ

Meristem kültürü; bitkilerin büyüme konileri veya büyüme konisi yanında birkaç yaprak primordiasının steril koşullarda yapay besi ortamlarında kültüre edilerek bunlardan tam teşekküllü bitkiler elde edilmesini kapsar. Meristemler bütün açık ve kapalı tohumlu bitkilerde sürgünlerin tam ucunda bulunan ve bitkilerin büyümesini temin eden 0,1 mm çapında 0,25-0,30 mm derinliğindeki dokulardır. Bu meristem hücrelerinin bölünüp çoğalma yeteneği meristem kültürü tekniğinin temelini oluşturur. Meristem kültürü bu bölünüp çoğalma yeteneğindeki dokuların tam bitki geliştirmek amacıyla yapay besin ortamında aseptik kültürüdür.

Meristem, devamlı olarak bölünebilme yeteneğine sahip hücrelerin oluşturduğudur. Bitkilerde kök ve gövde uçlarındaki büyüme bütün hayat boyunca devam etmektedir.

Meristem Kültürü Tekniğinin Esasları

Meristem kültürünün esasları kısaca şu şekilde sıralanabilir.

Bitkilerin sürgün ucu alınır ve yüzey sterilizasyonu yapıldıktan sonra, aseptik koşullarda ışık mikroskobu yardımıyla 0,2-0,3 mm büyüklüğünde 1-2 yaprak taslağı ihtiva eden meristematik doku çıkarılır, ve özel besin ortamına yerleştirilir.

Bu sürgün ortamında ya doğrudan sürgün oluşumu sağlanır yada alt kültür yapılarak çoğaltma sağlanır sürgün oluşturulur.

Sürgünler köklendirilir.

Agar ortamında gelişen bitkilerin steril toprağa veya vermikulite şaşırtılarak yetiştirilir ve böylece tam bitki elde edilir.

Vejetatif olarak üretilen pek çok bitki, ürünün kalite ve kantitesini azaltan sistematik virüslerle bulaşıktır. Bu virüsler bir ve getatif generasyondan diğerine geçmekte ve zamanla virüs konsantrasyonu artmaktadır. Böylece virüs birikimi sonucunda bitkinin gümraklığı ve verimi büyük ölçüde azalmaktadır.

1922 yılında Kotte ve Robbins ayrı olarak, kök uçlarının uygun bir mineral salusyonda gelişebileceğini saptamışlardır. Daha sonra white TMV ile bulaşık domates köklerini in vitro’da kültüre ayı başarmıştır. Yaptığı testler sonucunda, bu gibi kök parçalarının değişik kesimlerinde virüs konsantrasyonlarının farklı olduğunu ve uç kısımların dibe göre daha düşük düzeyde virüs taşıdığını saptamıştır.

Morel ve Martin virüslü dalgalardan izole ettikleri apikal meristemleri kültüre almışlar, ancak 1-2 cm boyunda köksüz bitkicikler elde etmeyi başarmışlardır. Bu bitkicikleri, virüssüz çöğürler üzerine aşılayarak sonuçta sağlıklı bitkiler elde edebilmişlerdir. Bu öncü çalışmadan sonra,pek çok araştırmacı meristem kültürü üzerinde çalışmıştır. Örneğin çilek, karanfil, nergis, patates ve asma gibi pek çok bitkide başarılı sonuçlar alınmıştır. Bu şekilde, gerek yalnız olarak ve gerekse termaterapi ile birlikte uygulanan meristem kültürü ile virüsler elemine edilmekte ve sağlıklı bitkiler geliştirilebilmektedir.

Virüssüz Bitki Elde Edilmesi

Bakteri, mantar, virüs, mikoplazma ve nematotların neden olduğu hastalıklar bitkilerde büyük verim kayıplarına neden olurlar.virüs ve mikroorganizmalar dışındaki hastalık etmenlerinin bir çoğu için etkin mücadele yöntemleri geliştirilmiştir. Ancak, virüs ve mikroplazmalarla mücadele için etkin bir yöntem mevcut değildir. Virüs hastalıkları hem tohumla çoğalan bitkilerde hem de vejetatif olarak çoğaltılan çok önemli verim kayıplarına neden olmaktadır.

Bitkiler virüs ile enfekte olduklarında, patojen generasyondan generaasyona geçmektedir. Bu durum ürünün verim ve kalitesinin generasyondan generasyona azalmasına neden olmaktadır. Yüksek verim ve kaliteli ürün elde edebilmek için üreticilere virüssüz tohumluk sağlanması gerekir.

Virüssüz tohumluk sağlanmasında kullanılabilecek yöntemlerden birisi, virüslere dayanıklı çeşit geliştirilmesidir. Ancak, virüslere dayanıklı çeşit geliştirebilmek için, öncelikle söz konusu virüse dayanıklılığı sağlayan geni taşıyan genetik bir kaynağın bulunması gerekir. Diğer taraftan, klasik ıslah yöntemleriyle virüslere dayanıklı çeşit geliştirilmesi, uzun yılları alan ve çok fazla iş gücü gerektiren bir işlemdir. Bu nedenle, virüssüz bitki elde edilmesinde aşağıda sıralanan diğer bazı yöntemlerden yararlanılmaktadır.

Sıcaklık uygulaması

Meristem kültürü

Sıcaklık uygulamasından sonra meristem kültürü

Kimyasal uygulaması ile meristem kültürü

Adventif sürgün oluşumundan sonra meristem kültürü

Meristemleri virüssüz anaçlara aşılanması

Sıcaklık Uygulaması

Bazı virüslerin inaktif hale getirilmesinde sıcaklık uygulaması etkin bir yöntem olmaktadır. Ancak, bazı durumlarda bitkinin sıcaklığa karşı çok duyarlı olması veya virüsün sıcaktan etkilenmemesi nedeniyle sıcaklık uygulaması virüs eleminasyonunda etkisiz kalmaktadır. Sıcaklık uygulamasında, bitkinin yaşayabildiği ve virüsün inaktif hale geldiği sıcaklı derecesi ve uygulama zamanı seçilmelidir.

Sıcaklık uygulaması özelikle meyve ağaçları ,şeker kamışı ve kazava bitkilerinde bulunan virüs ve mikroplazmalara karşı etkindir. Odun türlerde genellikle yan tomurcuklar sıcaklık uygulamasıyla virüssüz hale getirilir. Bu amaçla, anaç üzerine aşılanmış ve 20-40 gün 37-38 °C de bırakılmış olan bir daldan tomurcuklar izole edilerek virüssüz anaçlara aşılanır. Bağlarda ise, sürgünlerin in virto koşullarda 21 gün süreyle 35 °C de kültür edilmesiyle virüssüz bitkiler elde edilir.

Otsu bir tür olan stelleria media’da in vitro koşullarda kültüre alınan sürgün uçlarına sıcaklık uygulamasıyla salatalık mozaik virüsü elemine edilebilmiştir.

Meristem kültürü

virüssüz bitki elde edilmesinde en sık kullanılan yöntem meristem kültürüdür. White’ın tütün mozaik virüsünün tütün bitkisi kökünün farklı bölgelerinde farklı yoğunlukta dağılım gösterdiğini saptamasından sonra limasset ve casneft mozaik virüsünün tütün bitkisinin kökü boyunca gözlenen farklı yoğunluktaki dağılımının sürgün kısmında da gözlenebileceğini ve meristemin virüssüz alabileceğini ortaya atmışlardır. Daha sonra yapılan araştırmalar kök uçları ve sürgün meristemlerinin her zaman virüssüz olmadığını ortaya koymuştur.

1952 yılında Morel ve Martin Dahlia bitkilerinin meristemlerini in vitro koşullarda kültüre alarak ilk virüssüz bitkileri elde etmişlerdir. Morel ve Martin’in bu başarılarından sonra özellikle bahçe bitkilerinde olmak üzere patates, üçgül, çim ve tütün de meristem kültürü virüssüz bitki elde edilmesinde başarı ile kullanılmıştır.

Mersitem kültüründe sağlanan başarılar doğal olarak bitkinin farklı kısımlarında virüslerin neden farklı yoğunlukta dağılım gösterdiği sorusunu ortaya çıkarmıştır. Bu konuda bazı görüşler bulunmasına karşın bu soru tam olarak açıklanmış değildir. Bazı araştırmacılara göre, meristem de virüs pastiküllerinin oluşumu ile hücre çoğalması arasında bir rekabet vardır.

Matematik dokuda hücre bölünmesi sırasında nükleik asit üretimi kapasitesi hücre bölünmesi için kullanılmakta ve bu durum virüs çoğalmasını engellemektedir. Buna karşılık, mersitematik olmayan dokuda hücreler bölünme yerine büyüme göstermektedirler. Bu durum virüs çoğalmasına olanak sağlamaktadır. Ayrıca meristemde taşıma sistemlerinin bulunmayışı nedeniyle virüslerin taşınması büyük ölçüde engellenmektedir. Bazı araştırmacılar meristemdeki düşük virüs konsatrasyonunu, meristem de virüslerin çoğalmasını sağlayan bazı enzimlerin bulunmayışı ile açıklamaktadırlar. Bazı araştırmacılar ise, meristemde bazı engelleyiciler bulunması nedeniyle virüslerin burada çoğalamadığını savunmaktadırlar.

Meristem kültürü virüssüz bitkilerin elde edilmesinde kullanıldığı gibi, bakteri ve mantarlardan temizlenmiş bitkilerin elde edilmesinde de kullanılabilmektedir.

Sıcaklık Uygulamasından Sonra Meristem Kültürü

Birden fazla virüs cinsi ile bulaşık bitki materyalinden virüssüz bitki elde edilmesinde başarı şansını artırmak için genellikle meristem kültürü yapılmadan önce meristemlerin alınacağı sürgünlere sıcaklık uygulaması yapılır. Böylece, virüs konsantrasyonu azaltılır veya virüssüz bölge çoğaltılır. Meristem kültüründe çok küçük meristem bölgesi eksplantat olarak kullanılabilmesine karşılık sıcaklık uygulamasından sonra meristem kültürü uygulandığında daha büyük eksplantatlar kullanılabilir. Nitekim green ve lo tatlı patates sarı cücelik virüsünü elemine etmek için 0,3 mm’lik meristemleri kullanmalarına karşılık, ana bitkiler 37 °C de 1-2 ay tutulduktan sonra 1-2,5 cm uzunluğundaki meristem uçlarını kullanarak, bir virüsten arındırılmış bitkileri elde etmeyi başarmışlardır. Bu teknik patates, krizontem, karanfil ve çilekte başarı ile uygulanmıştır.

Kimyasal Uygulaması İle Birlikte Meristem Kültürü

Virüs eleminasyonunda meristem kültürü ile kombine edilmiş bir çok kimyasalın etkisi uzun yıllardan beri araştırılmaktadır. Bununla beraber, bu teknik sınırlı bir başarı sağlamış ve antivirül kimyasalların virüs üzerindeki etkisi ile ilgili olarak farklı sonuçlar elde edilmiştir. Salatalık mozaik virüsü ve patates X virüsü ile enfekte olmuş tütün bitkilerinden meristem kültürü ortamına geniş spektrumlu bir antiviral bileşik olan Ribavirin ( virazde) ilave edilerek virüsten arındırılmış bitkileri elde edilmiştir. Bu başarılı sonuçlardan sonra, birçok patates çeşidinde meristem kültürü ortamına Ribavirin eklenerek, virüssüz bitkiler elde edilmesi başarılmıştır. Ancak yapılan diğer bir araştırmada ise Ribavirin’in reglikasyonuna %72 oranında azaltmasına karşılık, patates yan gözlerine toksik etki yaptığı saptanmıştır.

Antiviral bileşiklerin virüs eleminasyonunda kullanılması ile ilgili olarak farklı sonuçların elde edilmesi bu bileşikleri virüs eleminasyonunda etkin olarak kullanılamayacağı düşüncesinin doğmasına yol açmıştır.

Yakın yıllarda Ribavirin yanında DMEB( Dedecyll-N–methylephedrinecinbromide), Vidarabine, DHT (2,4-diaxohexahydro-1,3,5-triazine ) gibi kimyasalların da virüs elminasyonunda kullanılması ile ilgili araştırmalar sürdürülmüştür. Ancak bu bileşiklerin genellikle bitki dokularına toksik etki yaptıkları ve tam olarak virüs eleminasyonunu sağlayamadıkları için bu kimyasalların yaygın olarak kullanılmadan önce detaylı bir şekilde test edilmeleri gerekmektedir.

Adventif Sürgün Oluşumundan Sonra Meristem Kültürü

Bu yöntem zambaklarda başarı ile uygulanmaktadır. Bu bitkilerden alınan pulcuklardan in vitro koşullarda soğancıklar oluşmakta ve soğancıklarda meristem 1 mm iken meristem kültürü ortamına aktarılmakta ve meristemden rejenere olan bitkiler virüssüz olmaktadırlar. Zambaklar dışında petünya, tütün ve kabakta da bu yöntemle virüssüz bitkiler elde edilebilmektedir. Bu bitkilerde, tamamen virüsle enfekte olmuş bitkilerin yapraklarında bazı bölümlerin virüssüz olduğu ve bu yaprak kısımlarından in vitro koşullarda virüssüz adventif sürgünlerin rejenere olduğu saptanmıştır.

Mersitemlerin Virüssüz Anaçlara Aşılanması

Meristemlerin in vitro koşullarda büyütülemediği veya meristemden oluşan sürgünün kök oluşturmadığı durumlarda meristem virüssüz anaca aşılanır ve in vitro koşullarda büyütülür ve çoğaltılır. Mikro aşılama olarak da bilinen bu yöntem, özellikle odunsu bitkilerden örneğin turunçgillerde ozaliptusta ve kayısılarda başarılı bir şekilde uygulanmaktadır. Çünkü bu bitkilerde meristem kültürü genellikle çok zordur.

Meristem kültüründen virüssüz bitki elde edilmesi dışında ve negatif üretim konusunda da yararlanılmaktadır. Vejetatif üretimde diğer bitki kısımları yerine meristemin kullanılmasının başlıca nedeni diploid bir bitkide apikal meristemin yeknesak diploid hücrelere sahip olmasıdır. Çünkü bitkinin diğer dokularında, farklı seviyelerde poliploid hücrelerin olması nedeniyle, bu dokuların kültüründen elde edilecek bitkilerinde poliploid olabilme ihtimali vardır.

Meristem kültürü vasıtasıyla gerçekleştirilen üretimden bitki ıslahında da yararlanılmaktadır. Örneğin ; kibrit çeşitlerin elde edilmesi için gerekli kendilenmiş ebeveyn bitkiler kendine kısırlık nedeniyle eşeysel olarak kolaylıkla çoğaltılamamaları durumlarında veya erkek kısır hatların çoğaltılmaları istendiğinde meristem kültüründen yararlanılmaktadır.

Meristem kültüründen yararlanılan diğer bir alan ise bitkilerin uzun süreli muhafazası ile ilişkilidir. Hastalıklardan temiz olması, boyutlarının küçük ve hızlı çoğalma özelliklerinden dolayı meristem bu tip uzun süreli muhafaza için uygun materyaldir.

EMBRİYO KÜLTÜRÜ VE İN VİTRO DÖLLEME

EMBRİYO KÜLTÜRÜ

Embriyonun , yumurtalık içindeki gelişmesinin belirli bir devresinde izole edilerek, özel bir gıda ortamında çimlendirilip , geliştirilmesine “embriyo kültürü “ denir. Diğer bir tanıma göre embriyo kültürü , tozlanıp döllenme olayı gerçekleştikten sonra tohum içinde bulunan ve belirli bir gelişme dönemindeki embriyolarının(iğ formuna sahip genç embriyoların) aseptik koşullarda tohumdan çıkarılması ve uygun bir besin ortamına aktarılması ile tam bitkilerin geliştirilmesidir.

Tohumun dışında embriyoların kültürü yeni değildir. Bonnet 1754’de fasulyede (phaseolus multiflonus) olgun tohumların kotiledanlarından embriyoları çıkararak çimlendirilmiştir. Ancak bu konudaki esas başarılı çalışmalar Hanning(1904) tarafından yapılmıştır. 1924 yılında Dietrich, farklı türlerin dormansi periyotlarını tamamlamamış embriyolarından in vitro kültür yoluyla tam teşekküllü bitkileri elde etmeyi başarmıştır. 1925 yılında Laiback, Linum pcrenne ile linum austriacum türleri arasındaki melezleme sonucu oluşan ve normal olarak bitki üzerinde gelişmeleri mümkün olmayan melez embriyoları in vitro kültür koşullarında kültüre alarak bu embriyolardan melez bitkileri elde etmeyi başarmıştır. 1945 yılından bu yana embriyo kültürü bitki ıslahcıları tarafından türler arası melezleme programlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Embriyo kültürü alınan enmbriyoları olgun ve olgunlaşmamış durumları göre iki tipi mevcuttur. Henüz olgunlaşmamış tohumlardan izole edilen olgunlaşmamış embriyoların kültürü, genellikle doğal koşullarda gelişmesini tamamlayamayan embriyolardan yaşama gücündeki bitkilerin elde edilmesi amacıyla yapılır. Gelişmesini tamamlamış tohumlardan izole edilen olgun embriyolar ise tohumun çimlenmesini engelleyen dormansiyi ortadan kaldırmak amacıyla uygulanır.

Embriyo kültürünün prensibi ;embriyoların steril koşullarda tohumdan izole edilmesi ve bu embriyoların uygun besi ortamına yerleştirilerek optimum koşullarda kültüre alınmasından oluşur. Embriyolar tohum içinde steril bir ortamda bulunmaları nedeniyle bunları steril olarak izole etmek oldukça kolaydır. Tohum veya kapsüller sterilize edildikten sonra birkaç saat veya birkaç gün su içinde bırakılır. Daha sonra embriyolar tohumlardan izole edilir. Küçük embriyolu bitkilerde izolasyon sırasında embriyoların zarar görmemesine dikkat edilmesi gerekir. Böyle durumlarda izolasyon işlemi mikroskop altında yapılmalıdır.

İzole edilmiş embriyolar uygun besi ortamlarında ve optimum fiziksel koşullarda kültüre alınırlar. Kültür sırasında bu embriyolardan tam bitkiler oluşur.

Embriyo Kültürünün Pratikte Kullanılma Alanları

Embriyo kültürü pratikte aşağıdaki amaçlar için kullanılır.

1. Çimlendirilmesi Mümkün Olmayan Tohumların Çimlendirilmesi

Bazı bitkilerin tohumlarını normal doğal koşullarda çimlendirmek mümkün değildir. Bu durumda bu türlerin tohumlarından embriyolar izole edilerek in vitro koşullarda çimlendirilmesi gerekir. Bu türlere örnek olarak Colocasia Esculanta, Musa Balbisiana ve Pinus Armandii X Pinus Koraiensis melezi verilebilir.

2. Mutlak Parazit Halde Yaşayan Bitkilerin Tohumların Çimlendirilmesi

Mutlak parazit halde yaşayan bitkilerin tohumlarını konukçu bitki olmaksızın çimlendirmek mümkün değildir. Bu durumda embriyo kültürü tekniği ile bu bitkilerin embriyolarından tam teşekküllü bitkiler elde edilebilir.

3. Yetiştirme Ve Islah Sürecinin Kısaltılması

tohum dorman sisi gösteren bir çok bitki vardır. Bu türlerde; endo spermlerdeki bazı engelleyiciler, çimlenme için özel ışık ve sıcaklıklara gereksinim duyulması veya embriyonun tam olarak olgunlaşmamış olması nedeniyle tohumlar kısa sürede çimlenemez. Embriyo kültürü tekniğiyle bu türlerde çok kısa sürede çimlenme sağlanır ve Bu türlerin yetiştirilme süreçleri kısalır. Bu teknik bugün orkidelerin ticari olarak çoğalmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Çimlenmenin hızlandırılması nedeniyle bu türler üzerinde sürdürülen ıslah çalışmalarında zaman tasarrufu sağlanmış olur.

4. Uyuşmazlık Nedeniyle Embriyoların Gelişemediği Durumlarda Normal Embriyo Gelişmesinin Sağlanması

Türler ve cinsler arası melezlemelerde ve farklı poliploidi düzeyindeki bitkilerin melezlenmesinde genellikle endosperm çok zayıf gelişir. Bu durumda embriyo gelişmesini tamamlayamadan ölür. Böyle durumlarda genellikle melezlemeden 2-3 hafta sonra embriyolar izole edilerek in vitro koşullarda kültüre alınır. Bu melez embriyoların normal gelişmeleri sağlanarak melez bitkiler elde edilebilir. Embriyo kültürü tekniği ile fasulye, keten, pamuk, domates, çeltik ve arpada türler arası melez bitkiler elde edilebilmektedir. Ayrıca yine bu teknik sayesinde Buğday x Çavdar melezlemesi sonucu oluşan embriyonun in vitro koşullarda kültürü ve bu embriyonun çimlenmesi sonucu meydana gelen bitkilerde kromozon katlaması yapılarak, bugün yeni bir tahıl cinsi olarak bilinen tritikale elde edilmiştir.

5. Erken Olgunlaşan Taş Çekirdekli Meyvelerde Zayıf Embriyo Gelişiminin Engellenmesi

Şeftali ,kiraz,kayısı ve erik gibi erken oluşan taş çekirdekli meyvelerde ,embriyoya su ve besin maddesi taşınması , embriyo tam olarak olgunlaşmadan kesintiye uğrar. Bu durumda embriyo tam olarak olgunlaşma ve erken olgunlaşan bu tip meyvelerde melez bitki elde edilemez.böyle durumlarda ,embriyo kültürünün kullanılması ile ,melez bitkiler elde edilebilir .Şeftali de yapılan çalışmalarda ,embriyonun alabildiğince uzun bir süre ona bitkide bırakılması ve daha sonra ın vitro koşularda kültüre alınması ile norma embriyo olgunlaşmasının sağlanabildiği saptanmıştır.

6. Haploid Bitkilerin Elde Edilmesi

Embriyo kültürü tekniğinin en önemli kulanım alanlarından biriside habloid bitki elde edilmesidir.Meternal habloid tekniği olarak bilinen bu teknik özelikle buğday ve arpada başarıyla uygulanan bir tekniktir .Bu yöntem ilk defa Kasha ve Kao (1970) tarafından arpada uygulanmıştır. Bu yöntemle haploid bitki elde edilmesinde ;kültür arpası (hardeum vulgare) ile yumruk arpa (hardeum bulbosum) melezlenmektedir. Bu melezleme sonucu oluşan zigotta hücre bölünmeleri sırasında yumrulu arpa kromozomları elemine olmaktadır. Bu durumda endospermin gelişmesi tamamıyla durmakta, embriyo gelişimi ise çok yavaşlamaktadır. Gelişmesi yavaşlamış olan haploid embriyo in vitro kültüre alınır. Böylelikle, normal doğal koşullarda gelişmesini devam ettiremeyecek olan embriyonun gelişmesi sağlanır. Gelişen bu haploid embriyo çimlenerek haploid bitkileri oluştururlar . daha sonra haploid durumdaki bu bitkiler kolçisin ile muamele edilerek kromozom sayıları iki katına çıkarılır ve homozigot bitkiler elde edilir. Klasik ıslah yönteminde 4-5 yılda erişilebilecek homozigotluk düzeyine bu yöntemle bir yılda erişilebilmektedir. Arpada uygulanan bu teknik buğdayda da uygulanmış ve başarılı olmuştur. Bu tekniğin yaygın olarak kullanılmasını engelleyen en önemli faktörlerden birisi genotiptir. Gerek kullanılan arpa ve buğday genotipleri, gerekse yumrulu arpa genotipleri başarının derecesini etkilemektedirler. Buğdayda sürdürülen araştırmalarda tetroplaoid yumrulu arpa baba olarak kullanıldığında melezlenen 100 buğday çiçeğinden 54 haploid elde edilmesine karşılık bu oran diploid baba ile %28,2 olmuştur. Heksaploid buğday çeşitleriyle yapılan araştırmalarda bazı buğday genlerinin yumrulu arpa ile döllenmeyi engelledikleri ortaya çıkmıştır. Bu durum karşısında haploid buğday elde edilmesi amacıyla buğdayın mısır ile malzemesi üzerinde durulmaktadır. 19 heksoploid buğday çeşidiyle sürdürülen araştırmalarda mısırla yapılan melezlemelerden, yumrulu arpa ile yapılan melezlemelere göre 3-4 kat daha fazla haploid bitki elde edilmiştir. Buğday mısır melezlemelerinde buğdaydaki melezlenebilirlik geninin etkisiz hale geldiği ortaya çıkmıştır.

7. embriyo gelişiminin deneysel olarak incelenmesi.

Embriyo kültürü yukarıda sayılan pratik kullanım alanları yanında embriyo gelişmesi için gerekli koşullar fitohormonlar ve çevre koşulları embriyo gelişmesine etkisi ve embriyonun beslenmesi gibi konuların incelenmesine de olanak sağlamaktadır.

İN VİTRO DÖLLEME

İn vitro yöntemler ıslah çeşitlerinin gelişmesi ve türler hakkında daha fazla bilgi elde edilmesindeki gibi değişik konularda ıslahçıya yardım eden tekniklerdir. Bununla birlikte in vitro teknolojide ancak birkaç ürün türünde başarı sağlanabilmiştir. Hücre kültürleri aracılığıyla ıslah programlarına uygulanabilen recombinant DNA teknikleri bitki ıslahçıları tarafından tanınmaktadır. Diğer taraftan doku kültürü bitkilerin fizyolojisi, biyolojisi, genetik, büyümesi ve gelişmesi hakkında moleküller düzeyinde araştırmalar yapmaya katkıda bulunmaktadır.

Embriyo kültürlerinin başarı ile uygulanmasında başka in vitro da yumurta ve yumurtalık tatbik edilmektedir. Bu teknik ile ilk defa 1960’larda haşhaş da (Papaver somneteruml) ardından kullanılmıştır. Bu yöntemde aseptik koşullarda döllenmenin yumurtalık uygun bir ortama taşır yada tozlanma ve döllenme tamamen in vitro koşullarında uygulanır. İn vitro da yumurta veya yumurtalık kültürleri aşağıdaki amaçlar için yapılır.

1.Melezlerin Üretimi

yapılan çalışmalarda doğada normal yollarla elde edilmeyen türler ve cinsleri arasında melezlerin elde edilebileceği sağlanmıştır. Meliondium album ve M. Rubumun dişi olarak kullanıldığı çalışmalarda dört farklı familyadan 15 farklı tür ile melez üretiminde başarılı sonuçlar elde edilmiştir.

Yine in vitro da yumurtalığın tozlanması ve döllenmesiyle lahana ve yağ şalgamı (Brassica oleraccae X B . campestris) melezinden sentetik ( Brassica Napus), çok yıllık çim ve kamışsı yumak ( Lolium parenne x Fertuca rubra) arasında bir melez elde edilebilmiştir. Mısırda ( Zea Mays) çeşitler arası melezler ortaya konulabilmiştir.

Stil, stigma veya yumurtalıktan ileri gelen eşeysel uyuşmazlık ve kendine kısırlık sorununun görüldüğü birçok bitkide in vitro teknik yumurta ve yumurtalık hücrelerine başarıyla uygulanabilmiştir. Bu durumda çoğu kez dişicik borusundaki bir mekanizmadan dolayı polen tüpü yumurta ve yumurtalığa erişemez veya geç erişir. Bu nedenle de döllenme zamanı geçmiş olur.

2. Haploid bitkilerin elde edilmesi. Gecikdirilmiş tozlama,uzak akrabalar arsı melezleme, cansız ve radyasyona tabi tutulmuş polen ile tozlama, yumurtalığın fiziksel etken veya kimyasal maddelerle muamelesi ve anther kültürleryle haploid bitkiler elde edilmektedir. Bunlara ilaveten in vitro tozlama ve dölleme tekniğini kullanarak da haploid bitkiler meydana gelebilmektedir. Mimilus luteus’ta bu yolla %1 oranında haploid bitki elde edilebilmiştir. Ayrıca Petunia’da X ışınlarıyla radyasyona tabii tutulmuş ve tozlamadan 5 gün önce tohum bağlama görülmüş, tozlamadan 9-14 gün sonra yumurtalıklar alınıp in vitro kültürü yapılmış ve böylece gyno genetik (yumurta kökenli ) haploidler elde edilmiştir. Bu duruma göre haploid petunia üretiminde X ışınlarıyla yapılan radyasyon sonucu in vitro yumurtalık kültürünün başarıyla uygulanabileceği gösterilmiştir. Polen fizyolojisi ve dölleme üzerinde yapılacak çalışmalarda da bu teknik kullanılabilir.

ANTHER KÜLTÜRÜ

Günümüzde haploid bitkilerin elde edilmesinde anther kültürü yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu tekniğin diğer in vitro haploid bitki elde etme tekniklerine göre avantajı; bir anter içerisinde binlerce mikrosporun bulunması ve uygun bir in vitro kültür sistemi ortaya konabildiğinde bir anterden çok sayıda haploid bitki elde edilmesidir.

İlk çiçekli haploid bitkiler Blakesler ve arkadaşları tarafından 1922 yılında açıklanmasına rağmen , o yıllarda kromozom katlaması başarılamadığı için bu konuda pek çalışılamamıştır. Fakat, bu çalışmalar anter kültürünün haploid bitkilerin üretiminde kullanılmasına kadar sınırlı sayıda olmuştur.

Çok genç polen hücrelerinden haploid bitkilerin elde edilmesi ve bu bitkilerde kromozom sayısının ikiye katlaması ile homozigot bitkilerin elde edilmesi tekniği oldukça yeni bir tekniktir. 1967 yılında Bourgin ve Nitsch ilk defa Nicatiana sylvestris ve Nicaitana tabacum türlerinde anter kültürü yoluyla haploid bitkileri elde etmişlerdir. Bourgin ve Nitsch bu başarılardan sonra, genetikçiler ve bitki ıslahçıları diğer bitki türlerinde de haploid bitkilerin elde edilmesi için büyük çaba harcamışlardır.

Anter kültürü tekniğinin geliştirildiği ilk yıllarda anter kültürü yoluyla haploid bitkilerin elde edilmesinin yalnızca Solanaccae ve Gramineae gibi belirli bazı bitki familyalarındaki türlerde mümkün olabileceği düşünülmüştür. Ancak bugün bunun böyle olmadığı, diğer familyalardan bitki türlerinde de az sayıda da olsa anter kültürü yoluyla haploid bitkilerin elde edilebileceği ortaya çıkmıştır.

Anter kültürünün temel prensibi; normal olarak erkek gameti oluşturacak polen hücresinin gelişmesini durdurmak ve somatik hücrelerde olduğu gibi polen hücresini doğrudan bir bitki oluşturmaya zorlamaktır. Anter kültürü yapmak için; kapalı olan çiçek tomurcukları sterilize edildikten sonra, tomurcuk ince bir pens ile açılarak stamenler dışarı çıkarılır ve bir petri kabına konulur. Fılamentler dikkatli bir şekilde stamenlerden ayrılırlar ve böylece serbest hale getirilen anterler katı veya sıvı kültür ortamına yerleştirilir. Anther izole edilirken çok dikkatli davranmak ve antheri yaralamamak gerekir. Yaralı anterler kallus oluşturma eğiliminde olduğundan, bunların kültüre alınmaması gerekmektedir. Kültürler 24-27 °C sıcaklık ve günde 14 saat yaklaşık 200 lüks’lük bir aydınlatma rejimine sahip odada inkübasyona alınırlar.

Bitki türüne bağlı olmakla beraber, polen bitkilerinin oluşması için yaklaşık 3-8 hafta gerekir. Ortalama 5 cm boyuna gelen bitkicikler gıda ortamından alınır. Yıkanarak agar artıklarının bitkiden uzaklaştırılması sağlanır ve içinde otoklavlanmış toprak harcı bulunan saksılara şaşırtılır. Saksıla, nemi yüksek olan bir seraya yerleştirilir. Kültür ortamında farklı bir ortama alınan bitkilerde ölümü azaltabilmek için, bir hafta kadar bitkilerin üzerlerinin beaker kapları ile örtülmesi yararlı olmaktadır.

Anter Kültürünün Kullanım Amaçları

Melezleme Islahında

kombinasyon ıslahında istenen karakterleri taşıyan ebeveynler arasında melezleme yapılarak F1 edildikten sonra F1 bitkilerinde enter kültürü yapılarak oluşacak haploid bitkilerde arzulanan gen kombinasyonlarının , özellikle dominant durumda kolayca seçimi sağlanır.

I.yıl

A çeşidi

B çeşidi

Aabb

aaBB

II.yıl

F1

AaBb

ANTER KÜLTÜRÜ

AB Ab

AB ab

(Haploid Bitkileri)

KATLAMA

(diploidleştirme)

AABB AAbb

.aabb aabb (diploid bitkiler)

Seleksiyon

AABB

III. ve IV. yıllar

-Performans testi

-Fizyolojik karakterler için test

-Adaptasyon için test

YENİ ÇEŞİT

Şekil 1. Kombinasyon Islahında Anter Kültürünün Kullanımı

Melezleme ıslahında anter kültürünün kullanılması ile çok sayıda dominant genin bir araya getirilmesi kolaylaşır. Normal yolla melezlemeden sonra meydana gelecek erken açılma generasyonları (F2,F3) elimine edilir. Kendine döllenen bitkilerde kısa sürede homozigot hatlar oluşturulabilir. Bu yolla çeltikte yüksek verimli , çeltik yaprak yanıklığına dayanıklı ve çevreye uyum yeteneği yüksek çeşitler geliştirmişlerdir. Buğday ve tütünde anter kültürü ile elde edilen ve geliştirilen hatlar ıslah programlarında kullanılmıştır.

Heterosiste

Melez uzmanlığında (heterosis) faydalanabilmek için bunların sürekli F1 tohumlarını üretecek kendilenmiş homozigot hatlarının elde edilmesi gerekmektedir. Bu ise daha önce de belirtildiği gibi oldukça uzun bir süreyi (6-7 yıl ) ve masraflı bir çalışmayı gerektirmektedir. Ayrıca bir takım kendileme depresyonları nedeniyle istenilen başarıya ulaşabilmek her zaman mümkün olmayabilir. Anter kültürlerinin kullanımıyla bunlar ve diğer bazı sorunlar ortadan kaldırılabilir. Elde edilen kromozomları katlanmış hatların genel ve özel kombinasyon yetenekleri belirlenir, daha sonra bunlardan filer kısa sürede, daha bir emek ve masrafla üretilebilir. Nitekim mısırda anter kültürüyle çok sayıda katlanmış hatlar elde edilmiş ve bunlar F1 üretiminde kullanılmıştır.

Mutasyon ve Seleksiyon Islahında

Haploid bitkiler katlanmadan veya katlandıktan sonra mutasyon ve seleksiyon ıslahatında kullanılabilirler. Bir gen mutasyona uğradığında mutasyonlar çoğunlukla ve resesif olduğu için sonuçta fenotipik değişimler görülmeyebilir. Böyle bir mutasyona uğramış genler dublike oluncaya kadar mutasyon devam eder. Bu gibi durumlarda resesif karakterleri ortaya çıkarmak için kendileme gerektirmektedir.bu ise mutasyon ıslahatında çok geniş bir populasyonla çalıştığı için genellikle yabancı döllenen bitkilerde çok güçtür ve daha önce de belirtildiği gibi bazı bitkilerde kendine uyuşmazlık olduğu için bu şekilde döllenme mümkün değildir.Kendileme mümkün olsa bile , gerek kendine ve gerekse yabancı tozlaşan bitkilerin kendilenmesi sonucunda resesif karakterler tek birgen çifti için 1:4 oranında görülecektir. Haploidlerden elde edilen homozigot diploidlerde resesif genler tarafından yönetilen özelliklerde dominant genlerin baskısı alınamayacağından bu özellikler kolayca görülebilirler. Bu yüzden mutant fertler kolayca ve etkili bir şekilde seçilebilirler. Ayrıca anter kültürü öncesi anterlerin radyasyona tabi tutulması ve bunların kültürüyle veya anter kültürü sırasında ortama etilmetan sülfanat (EMS) ve benzeri mutagenler katılmak suretiyle mutasyonlar ortaya çıkabileceği gibi , anter kültüründen geliştirilmiş tüplerdeki bitkilerin yetiştirilmesi sırasında bitkicikler doğrudan bir radyasyona maruz bırakılarak mutasyon uygulamaları da yapılabilir. Ayrıca, anter kültürü ile elde edilen haploid bitkilern hücre veya protoplast kültürleri yapılabilir veya bunların kültür ortamına mutagenler uygulanarak daha sonra hastalıklara , tuna , kuraha ve benzeri koşullara dayanıklılık için çeşitli faktörlere maruz bırakılarak buradan elde edilecek bitkiciklerden kromozom katlanmasıyla yeni çeşitler geliştirilebilir.

Bitki ıslahında haploidlerin yukarıdaki yararlanma olanakları yanında , aneuploid soyların üretiminde de kullanılabilirler. Bunlar sayesinde de istenilen karakterlerin kontrol eden gen yada genleri taşıyan kromozom veya kromozom segmentinin yabani türlerden kültür çeşitlerine aktarılması için kromozom eklemeli, aktarmalı ve yer değiştirme hatları oluşturulabilir. Böylece yabanilerle kültür bitkileri arasındaki melezlemeler sonucunda yabanilerin istenilen özellikleri yanında istenilmeyen çok sayıda özelliğin döle geçmesini önlenerek amaca daha kolay ulaşılabilir. Aneuploid bitkilerin ıslahtaki bu yararlarına ilaveten, çeşitli bitkilerin monozomik, nullizomik hatlarının elde edilmesi sonucunda hangi genlerin hangi kromozonlar üzerinde yer aldıkları da belirlenebilmektedir. Bunlar kromozom eşlenmesi ilişkilerinde de kolaylık sağlar. Özellikle kendine döllenen bitkilerde dejenere olmuş çeşitlerin hızla saflaştırılmasında da anter kültürü kullanılabilir.

Sitolojik Çalışmalarda

Özellikle yabancı döllenen bitkilerin karyotip analizinde haploidleri kullanmanın yararlı olacağı belirtilmiştir. Ancak bu bitkilerde belirli bir sıklıkta homolog kromozomlar arasında uzunluk ve küçük yapı farklılıkları bulunabilmektedir ve sentromerin durumunda değişiklikler görülebilmektedir. İşte bu tür olumsuzlukların ortadan kaldırılması ve daha doğru sonuçların elde edilmesi için haploidlerin kaplanmışları kullanılmaktadır. Bu amaçla şeker pancarı ve çavdarın haploidlerinin katlanmışlarında karyotip analizi yapılmış ve haploid durumda karyotip analizinin kolay ve daha hassas olduğu belirtilmiştir. Karyotip analizinden başka, haploidler buğday da erkek kısırlığın stoplanmik mi yoksa genetik mi olduğunun belirlenmesi de kullanılmıştır. Ayrıca solunum nigrum’un haploidler ve dihaploidler yardımıyla filogenetiği incelenebilmiştir.

Bütün bunlardan başka, bazı türlerde ante4r kültürüyle elde edilecek haploidlerden fertil homozigot diploidlerin oluşturulmasıyla normalde ve jevatif yolla üretilen bitkilerden tohumla generatif yolla üretin yapılabilir. Örneğin patates de kültürü yapılan çeşitli tetroploidler bulunmaktadır. Bunlardan anter kültürüyle dihaploidler elde edilir ve bunlar fertildirler. Bu durumda patates de yumrularla çoğaltma yerine tohumlarla çoğaltma yapılabildiği gibi ve viral hastalıklar nedeniyle bozulmalardan da kurtulmuş olur. Patatesteki bu durumdan ayrıca kombinasyon ıslahında daha iyi planlar yapılmasında da yararlanılabilir. Örneğin anter kültürüyle elde edilen dihaploidler patatesin yabani dihaploidleri ile kolayca melezlenebilir. Bunların katlanmasıyla üstün karakterli çeşitler elde edilir.

KALLUS KÜLTÜRÜ

Kallus düzenli olmayan (organize olmamış ) hücrelerin oluşturduğu bir yara dokusudur ve doku kültürlerinde yapılan çalışmaların çoğunda bir kallus aşamasından geçilerek başarıya ulaşılır. Bu nedenle kallus dokusunun başlatılması, geliştirilmesi ve bunlardan yaşayabilir bitkilerin elde edilmesi herhangi bir doku kültürü çalışmasında başarılması gereken ön koşullardandır. Yani kallus kültürler bu yönüyle bitki doku kültürlerinin en önemli başlangıç adımını oluşturur. Bunun yanı sıra kallus kültürü değişik amaçlarla da yapılmaktadır.

Kallus Kültürünün Uygulanması

Kallusu geliştirmek için bitkilerin hücre bölünmesinin mevcut olduğu gena dokular tercih edilmekle beraber bir bitkinin herhangi bir kısmı; çiçekler, olgunlaşmamış endosperm ve embriyolar yapraklar, gövde parankiması , rachis, hipokotil, petioller ve yaprak orta damarı , kotiledonlar , boğumlar ve benzeri kısımlar kallus oluşturmada başlangıç materyali olarak kullanılabilirler.

Genu bir yaprak bitkiden alınır ve sterilize edildikten sonra küçük parçalara ayrılarak oksin içeren uygun besi ortamında kültüre alınır. Uygun kültür koşullarında korunan bu yaprak eksplantatlarında kallus oluşur. Oluşan kallusun daha fazla büyümesi için , kallus yeni ortama aktarılır. Daha sonra kallusun rjenerasyonu için kallus rejenerasyon ortamına aktarılır. Eğer elde edilen kallus embriyonik ise genellikle rejenerasyon ortamına büyüme düzenleyici ilavesi gereksizdir. Böyle bir besi ortamında somatik embriyolar çimlenerek sürgün ve köklü bitkicikleri oluştururlar. Oluşan bitkicikler yeterli derecede büyümeleri için kullanılan temel besi ortamının içeriği makro ve mikro besin elementlerinin yarı konsantrasyonlarını içeren besi ortamına aktarılır. Bu ortamda şeker konsantrasyonu da azaltılır. Bitkicikler ışıklı ortamda ve uygun sıcaklık koşullarında 3-4 hafta büyümelerine devam ederler (Şekil 2). Bu süre sonunda saksılara aktarılan bitkiler 3-4 gün sera içerisinde plastik örtü altında tutularak çevreye uyumları sağlanır.

Eğer kallus embriyonik değilse, sürgün oluşum amacıyla stokinin içeren besi ortamına aktarılır. Bu ortamda kallustan sürgün oluşumu gerçekleşir. Oluşan sürgünler oksin içeren besi ortamında kültüre alınarak köklendirilir.

Kallus Kültürünün Yapılma Araçları

Kallus yığınlarından bitkilerin çoğaltılması için yararlanılır: Kültüre alınan bitki kısımlarından önce kallus oluşumu sağlandıktan sonra bu kallus parçalanarak parçalardan sürekli alt kültür yapmak suretiyle çoğaltılır. Daha sonra bunların gelişme ortamlarına değişik miktarlarda büyümeyi düzenleyiciler(oksinler, sitokinler vb.) katılarak bunlardan kök ve sürgün gelişimi teşvik edilip , bitkicikler elde edilir.

Kallus kültürlerinde ortaya çıkan varyasyonlardan yararlanılması: Doğada bitkilerin yararlanan kısımlarında, yarayı kapatabilmek için kallus dokusu oluşturulmaktadır. Bu dokularda az miktarlarda da olsa çeşitli poliploidleşmeler olabileceği çok uzun süreden beri bilinmektedir. Kallus kültürlerinden edilen bitkiler arasında marfoloji, ploidi düzeyi, kromozom sayısı, verim ve enzimatik ürün yönünden varyasyonlar olduğu bir çok araştırmacı tarafından belirtilmiştir. Bu tür genetik varyasyonlar uzun süreli kültürlerde kültürün yaşı ilerledikçe artar. Kallusun gelişmesi sırasında kromozom katlanmasına (polipoidleşme) yaklaşım vardır ve bu endopolipladi yoluyla meydana gelir. Ayrıca aneuploidiye de sık rastlanmaktadır.

Kromozom sayılarındaki değişiklşikler yanında delesyonlar, translokasyonlar ve inversiyon gibi kromozomlarda yapısal değişiklikler de meydana gelmektedir. Kallus kültürlerinde görülen kromozom yapı ve sayısındaki değişimlerden ileri gelen genetik varyasyonlardan her ne kadar başlangıçta tekniğin kullanışlı olmaması açısından araştırmacılar tarafından bir engel gibi kabul edilmişse de daha sonra bu varyasyonlardan bitki ıslahında ve genetik çalışmalarda yararlanılabileceği anlaşılmıştır. Üzerinde yoğun ıslah çalışmaları yapılmış bitkilerde genetik varyasyonlar daralmış ve bu durum ıslahçıların yeni varyasyon kaynaklarına yönelmelerini gerektirmiştir. İşte kallus kültürleri bu yönden sahşp olduğu potansiyelle ıslahçıların ihtiyaçlarına belli ölçüde cevap verebilir ve kallus kültürlerinden tarımsal kullanıma uygun bitkiler geliştirilebilir. Kallus kültürlerinde görülen poliploidleşme özelliğinden anter kültürüyle elde edilmiş haploidlerin katlanmasında ve ayrıca diğer katlama işlemlerinde de yararlanılabilir.

Yine yukarıda bahsedildiği gibi , ortaya çıkan aneuploidi sayesinde bitkilerin her kromozon yönünden uneuploid hatları oluşturulabilir. Bu aneuploid hatlar bitki ıslahında kromozom eklemeli (adisyon), aktarmalı (tanslakasyon) ve yer değiştirmeli (substitisyon) hatlarının elde edilmesiyle büyük öneme sahiptir. Çünkü, bu yolla yabanilerle kültür formları arasında yapılan melezlemeler sonucunda yabanilerin çok sayıda istenmeyen özelliklerinin kültür formlarına geçmesi engellenir. Ayrıca bunlar genetik analizlerde hangi genlerin hangi kromozom yer aldığının belirlenmesinde ve kromozom ilişkilerinde anlaşılmasında da kullanılır.

Mutasyon Çalışmalarında Kullanılması: kallus küktürleri bitki ıslahında geniş ölçüde yararlanılan mutasyon çalışmaları için çok kullanışlıdır. Kallus kültürü sırasında doğrudan mutasyona rastlanıldığı gibi kültür sırasında besin ortamına etil metan sülfanat ve di etil sülfat gibi kimyasal mutagenler ilave edilerek ya da kallusu doğrudan veya dolaylı fiziksel mutagenler ( radyasyon, sıcaklık vb. ) uygulanarak mutasyonun şiddeti artırılabilir. Kallus kültürleri sırasında kendiliğinden meydana gelen mutasyon oranı doğadakine göre çok fazladır. Gerek doğal gerekse yapay mutasyonlar sonucunda uygun yeni genotipler elde edilebilir. Ayrıca, kallus kültüründe her şey kontrollü koşullarda gerçekleştiği için çalışmalar daha kolaydır. Bu gibi koşullar istediğimiz özellikler yönünden seçim yapmamıza da büyük kolaylık sağlar. Örneğin kallus mutasyona maruz bırakıldıktan sonra yetiştirildiği ortama hastalık etmenleri, tuz vb. maddeler ilave edilerek veya kültür şartlarının ayarlanması ile hastalığa, tuzağa, soğuğa, kurağa vb. koşullara dayanıklılık yönünden seleksiyon yapılabilir. Nitekim bu yolla haploid petunia hybridi’da sitreptomisine dayanıklı hatlar, çeltikler tuzağa dayanıklı bitkiler elde eedilmiştir. Bitki ıslahı açısından kallus kültürleri gerek sahip oldukları genetik varyabilite ve gerekse mutasyon çalışmalarında kullanım kolaylığı ve seleksiyondaki etkinlik nedeniyle üstün genotipli bitkilerin geliştirilmesinde büyük bir potansiyele sahiptir. Ayrıca, çeşitli yönetmenlikleri ile kombine edilerek ıslah çalışmalarında kolaylıklar sağlayacaktır.

Hücre Ve Doku Kültürü İçin Başlangıç Materyalini Oluşturulması:

Kallus kültürlerinin bitki ıslahı ve vegatatif kullanım amacının dışında, bunlar yapılarını oluşturan hücrelerin kolayca dağılmaları nedeniyle hücre ve protoplast kültürlerinin elde edilmesinde başlangıç materyali olarak kullanılırlar.

Bitki Sekonder Metabolitlerinin Elde Edilmesinde:

Son yıllarda kallus kültürlerinin bir diğer kullanım alanı da bitkilerde elde edilen alkoloidler, sitokininler, steroidler ve benzeri ikinci metabolit ürünlerin kallus kültürleriyle üretimidir. Kallus kültürlerinde bu bileşikler bitkide bulunduklarına göre ok daha yüksek oranlarda oluşurlar. Örneğin Digitalis purpurea’nın kallus kültüründe kardenolid glikozidi bulunduğu belirlenmiş ve kültürden izole edilebilmiştir. Drosera deltoidea’da kallus kültüründe %1’i aşan düzeyde steroid drasgenin elde edilmiştir. Ginseng bitkisinin kallusu %4 saponin ihtiva etmiş olup bu oranlar bitkilerde bulunana göre 4-8 kat daha fazladır.

Bu yönüyle gelecekte özellikle insanlar için yaşamsal önemi olan bitkiler tıbbi bileşiklerin deney tüpü gibi oluşturulmuş büyük kültür oranlarında elde edilebileceği beklenmektedir.

Genetik Materyalin Korunması

Bitki ıslahında önemli konulardan biri olan genetik materyalin korunması için doku kültürüyle koruma yöntemi kullanılmaktadır. Bu amaçla bitkilerin çeşitli şekillerde doku kültürleri de bunlardan biridir. Ancak kalluıs kültürleri sahip oldukları genetik varyabilite nedeniyle bazı araştırmacılar tarafından özellikle önerilmektedir.

HÜCRE KÜLTÜRÜ

Bitki hücreleri tipik olarak anter kültüründe olduğu gibi tek bir hücreden bölünme ve farklılaşma yoluyla organ ve tam bitkileri oluşturma potansiyeline, yani doku hücrelerindeki deyimiyle totipotansi özelliğine sahiptir. Hücrelerin sahip oldukları bu totopotansi’den yararlanılarak doku kültürlerinde, hücre kültürlerinden değişik amaçlar için bitki elde edilmeye çalışılır. Ayrıca bilindiği gibi bitkinin yapısını oluşturan somatik hücreler, geldikleri ebeveynin bütün kalıtsal özelliklerine sahiptirler, yani adeta onun kopyasıdırlar ve bu hücrelerden gelişecek bitkiler ebeveynleri ile aynı genetik yapıya sahiptir.

Hücre kültürlerinin elde edilmesinde 0,5 g kallus 50 ml sıvı besi ortamı içeren 200 ml’lik erlen kabına aktarılır. Bu kap bir çalkalayıcı üzerine yerleştirilir ve çalkalayıcının hızı 100-150 devir/dakikaya ayarlanır. Çalkalama sırasında kallusu oluşturan hücreler, bireysel hücrelere veya hücre kümelerine ayrılır. Periyodik olarak kültürlerin besi ortamına yeni ortama ilave edilerek, hücrelerin hızlı bir şekilde çoğalmaları sağlanır. Hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, bu süspansüyondan bir pet yardımıyla 10 ml’lik süspansiyon alınır ve içinde 40 ml tene besi ortamı bulunan yeni bir erlen kabına aktarılır. Böylelikle alt kültüre alınmış olur. Son yıllarda süspansiyon kültürleri üzerindeki çalışmalarda büyük gelişmeler sağlanmış ve birçok bitki türünde tekbir hücreden tam teşekküllü bitki rejenerasyonu gerçekleştirilmiştir.

Hücre Kültürlerinin Kullanım Alanları

Hücre kültürlerinin elde edilmesi ve tekbir hücreden hücre rejenerasyonunun başarılması bitkilerin hücre düzeyinde manipulasyona olanak sağlamıştır. Hücre kültürlerinin kullanım alanları aşağıda açıklanmıştır.

İn Vitro Seleksiyon

hücre kültürleri klasik bitki ıslahında kullanılan bitki düzeyindeki seleksiyona alternatif bir yöntem olarak kullanılabilmektedir. Hücre kültürlerinin varyasyon yaratılması ve istenilen varyanların seçilmesinde kullanılması bitki ıslahındaki geleneksel seleksiyon yöntemlerine göre birçok avantajlar sağlamaktadır. Bu avantajlar aşağıdaki gibi sıralanabilir:

Bir test tüpü içerisinde 100 milyon adet hücreyi kültüre almak ve bunlardan seleksiyon yapmak mümkündür. Buna karşılık aynı sayıdaki bitki ile çalışmak için 10000 ha’lık bir alana gereksinim duyulur.

Eşey hücrelerinden elde edilen haploid kromozon sayısına sahip hücrelerle çalışıldığında, resesif durumdaki mutasyonların ortaya çıkarılması ve bunların seçilmesi çok kolaydır. Bilinen klasik ıslah yöntemiyle bu tip mutasyonların ortay çıkarılması güçtür ve zaman alıcıdır.

Mutasyona uğrayan tekbir hücreden bitki rejenerasyonu sağlanabildiği için kimerik bitkilerin (genetik farklılık gösteren hücre gruplarını içeren bitki) ortaya çıkması önlenir.

Hücre kültürlerinde seleksiyon uygulanmasında, hücreler herhangi bir kimyasalın veya patojenin toksik maddesinin toksik etki gösteren konsantrasyonunu içeren besi ortamlarında kültüre alınır. Mutant hücreler böyle bir ortamda büyümelerine devam ederler. Toksik maddeden etkilenen hücreler ölür. Yapılan araştırmalarda nükleik asit ve amino asit ve amino asit benzeri maddelere, atrazin, 2,4-D ve NaCl’e dayanıklı hücre hatları seçilmiş ve bu hücrelerden bitki rejenerasyonu gerçekleştirilmiştir. Tütün hücre ve protoplast kültürleri ile yapılan araştırmalarda yapısal olarak hem methianin nem de vahşi yanıklık hastalığın etmeni olan Preudomonas tabaci bakterisinin toksinine benzeyen methioninsulfıximin maddesine dayanıklı hücreler seçilmiştir. Bu hücrelerden rejenere olan bitkilerin normal bitkilere göre beş kat daha fazla methionin içerdiği ve pseudomonas tabaci bakterisinin enfeksiyonuna daha az duyarlı oldukları saptanmıştır. Yapılan genetik analizler, bitkilerde ortaya çıkan bu farklılığın kalıtsal olduğunu ortaya koymuştur. Bu araştırmanın sonuçlarına göre bitkilerde beslenme açısından önemli amino asitlerin konsantrasyonları arttırılabilir ve bitkilerin patajonlere karşı duyarlılıkları azaltılabilir.

Hücre kültürleri ile yapılan araştırmalarda streptomycine dayanıklı tütün bitkileri ve çok yüksek 2,4-D konsantrasyonlarına tolerans gösterebilen havuç bitkileri seçilmiştir. Eğer gelecekte uygun seleksiyon yöntemleri ortaya konabilirse belirli bitki metabolitleri daha yüksek oranda içeren, çeşitli toksik maddelere, aşırı soğuk ve sıcağa, tuzluluğa yüksek taban suyu seviyesinde ve düşük toprak verimliliğine toleranslı bitkilerin elde edilmesi mümkün olabilecektir.

Protoplast Kültürlerin Elde Edilmesi

Hücre kültürleri protoplast izolasyonu için başlangıç materyalini oluştururlar. Hücre kültürlerinden izole edilen protoplastlar somatik melezleme ve gen transferi gibi daha komplike biyoteknolojik uygulanmasına olanak sağlar.

Sekonder metabolitlerin üretilmesi

Hücre kültürlerinin pratikteki kullanım alanlarından birisi de, tıp vr endüstrinin değişik alanlarında kullanılan alkaloidler, glikopzidler, eterik yağlar, steroidler, terpenoidler, phenolik bileşikler gibi birçok sekonder metabolitlerinin( bitkinin ürettiği fakat doğrudan kullanmadığı metabolitler) in vitro kültür yoluyla biyosentezidir.

Bitki hücre ve doku kültürlerindeki gelişmeler, penisilin gibi tıbbi bileşiklerin mantarların kültürü ile elde edilebildiği gibi bitkisel sekonder metobalitlerinin bitki hücrelerinin sıvı besi ortamlarında süspansiyon halinde kültür elde edilmeleri ile elde edilebileceği düşüncesini doğurdu. Hücre kültürleri ile bitkisel sekonder metobolitlerinin üretimi bitkilerinden bu ürünlerin elde edilmesine göre aşağıdaki avantajları sağlayabilir:

Söz konusu bileşikler kontrollü koşullarda üretilebilir.

Kültür edilen hücreler her türlü mikrop ve insektisitlerden arınmış durumdadırlar.

Herhangi bir bitkinin hücreleri belirli bir metoboliti üretmek üzere çoğaltılabilir.

Hücre büyümesi otomatik olarak kontrol edilebilir ve metabolik olaylar düzenlenebilir.

Hücre kültürünün yukarıda sayılan özellikleri sekonder metabolitlerin üretiminde verimliliği artırır, işgücü ve masrafı azaltır. Her şeyden önce sekonder metabolit verimi elde edilebilmeli ve öncelikle de ekonomik üretim yapılabilmelidir. Belirli bir sabit verim alabilmek için hücrelerin genetik stabilite göstermeleri gerekir. Hücre kültürlerinde yüksek bir sekonder metabolit elde edebilmek için, hücre kültürlerinin oluşturulmasında kullanılan kalkusun istenilen sekonder ürünü yüksek oranda içeren bitkilerden alınan eksplantatlardan oluşturulması gerekir. Hücre kültürlerinde belirli sekonder metabolit üreünlerinin verimi belirli ışık, besin maddeleri ve büyümeyi düzenleyiciler gibi çevre koşulları, marfolojik ve kimyasal farklılaşma ve biyosentetik kapasite gibi biyolojik faktörlerden etkilenir.

Hücre kültürlerinde sekonder maetabolitlerin elde edilmesi konusunda henüz bir çok sorun vardır. Bu nedenle, bu teknik bugün pratikte yaygın olarak kullanılmamaktadır. Bugüne kadar hücre kültürlerinden endüstriyel ölçüde sekonder metabolit üretimi sadece Japonya’da gerçekleştirilmiştir. Bu ülkedeki bir firma Lithospermum ernthorlizan bitkisinin hücre kültürlerinden bir boya ve antimikrobiyal bileşik olan stikonini ticari olarak üretmeyi başarmışlardır.

PROTOPLAST KÜLTÜRÜ

Bitki hücrelerinin plazma membranları selülozdan oluşan bir duvarla çevrilmiştir. Doku içindeki hücreler peletinde zengin bir matriks ile birbirine bağlanmıştır.mekanik olarak veya enzimlerle hücrelerin birbirinden ayrılması ve hücre duvarlarının uzaklaştırılması sonucu hücre duvarı olmayan çıplak hücreler olarak bilinen protoplastlar elde edilir.

Yüksek bitkil

Kategori: Biyoloji


Rasgele...


Destekliyoruz arkada - arkadas - partner - partner - arkada - proxy - yemek tarifi - powermta - powermta administrator - Proxy