T.c.
12 Temmuz 2007
T.C.
EGE ÜNİVERSİTESİ
FEN FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ
TEMEL VE ENDÜSTRİYEL MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
TEK HÜCRE PROTEİNİ ÜRETİMİ
ENDÜSTRİYEL MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR ÇALIŞMASI
HAZIRLAYANLAR
982581 AYŞE EMRE KANTIK
982811 SEVDA YAVUZ
982909 ŞENGÜL YILMAZ
994878 MELEK ÖZGÜR
TESLİM ALAN: ARŞ.GÖR. ALİ KOÇYİĞİT
Bornova/İZMİR
2003
İÇİNDEKİLER
1.Giriş
2.Tek Hücre Proteini Ve Kullanım Alanları
3.Tek Hücre Proteini Üretiminde Kullanılan Karbon Ve Enerji Kaynakları
3.1. Endüstriyel Artıklar
3.2. Tarımsal Artıklar
3.2.1. BaşlıcaTarımsal Artıklar
4. Tek hücre Proteini Üretiminde Kullanılan Mikroorganizmalar
5. Özdekler Ve Yöntemler
5.1 Özdekler
5.1.1. Kullanılan Organizma
5.1.2. Kullanılan Substat
5.1.3. Besiyerleri
5.1.4. Mineral Madde Solusyonu
5.2 Yöntemler
5.2.1. Substrata Uygulanan İşlemler
5.2.2. İnokulum Hazırlanması
5.2.3. Mikrobiyal Protein Üretme İşlemleri
5.2.4. Üretme SonundaUygulanan İşlemler
6. Bulgular
6.1. İnokulum Miktarlarının Verime Etkisi
6.2. Farklı Organik Ve İnorganik Azot Kaynaklarının Verime Etkisi
6.3. Ortama Eklenen Farklı Nutrientlerin Verim Üzerine Etkisi
6.4. Farklı Ph Derecelerinin Verime Etkisi
6.5. Farklı İnkübasyon Sıcaklıklarının Verime Etkisi
6.6. Mikrobiyal Proteinin Total Protein İçeriği
7. Kaynakça
1.GİRİŞ
Dünyadaki protein yetersizliğine yanıt arama çalışmalarında,insan ve hayvan beslenmesinin temel öğelerini oluşturan protein,lipid,karbonhidrat,vitamin ve mineral maddeleri basit organik ve anorganik maddelerden hızlı bir şekilde sentezleyebilme özelliğine sahip olan mikroorganizmalar giderek önem kazanmaktadır.Özellikle mikrobiyal üretim sonucu oluşan biyomasın protein içeriğinin yüksek olması ve üzerinde çalışılmış olan bir çok mikroorganizma türünün temel aminoasitlerini içermesi,bu yönde yapılan çalışmaların önemini daha da arttırmıştır.
Bu nedenle besin endüstrisi ve tarımsal artık ve atıkların bugün dünyamızda,yurdumuzda önemli bir sorun haline gelmiş bulunan çevre kirlenmesinin önlenmesi açısından,substrat olarak kullanımı yalnızca arıtma işlemleri yerine mikrobiyal parçalanma ile hem buna çözüm bulmak hem de sonuçta ekonomik değeri olan bir ürün elde edebilmeyi amaçlamaktadır.
Bu gibi artıkların tek hücre proteini üretiminde substrat olarak kullanılması hem artıkların sorun olmasını önleyecek,geliri arttıracak hem de sonuçta besin yetersizliğini çözüm getirecek kaynaklardan birisini oluşturacaktır.
2.TEK HÜCRE PROTEİNİ VE KULLANIM ALANLARI
Besin proteini elde etmek amacıyla;bakteri,maya,alg,fungus gibi mikrobiyal hücrelerin üretilmesiyle elde edilen ürüne tek hücre proteini adı verilmiştir. Tek hücre proteinine biyomas,biyoprotein,mikrobiyal protein gibi isimler verilmektedir.
Tek hücre proteini %50-%85 saf protein içeren konsantre bir üründür.(Taylor ve Serior,1978) Tek hücre proteini yüksek aminoasit içeriğine sahiptir. Sindirilebilir ve biyolojik yöntemlerle elde edilebilir. Ayrıca çeşitli mineralleri,vitaminleri,karbohidrat ve lipidleri de içermektedir. Tek hücre proteini ile yapılan aminoasit analizlerinde lizin ve metionin gibi temel aminoasit içeriklerinin yüksek olduğu sadece kükürtlü aminoasitlerce fakir oldukları tespit edilmiştir.
Beslenmede çok eskiden beri kullanılan mikroorganizmalardan biri de mayalardır.Mayalar çok eskiden beri özellikle fırıncılıkta kullanılmaktadır.Mayalanarak pişirilen yiyeceklerde pişme sırasında hücrelerden açığa çıkan proteinler,yağlar,karbonhidratlar bulunur.Günümüzde ise tek hücre proteini, yiyecekleri yüksek protein düzeyine getirmek ve diğer yiyeceklerdeki nutrientleri kazandırarak iyileştirmek için katkı maddesi olarak kullanılabilmektedir.Bununla birlikte:tek hücre proteini yüksek nükleik asit içeriği nedeniyle direkt insan tüketimi için uygun değildir.Besinlerle fazla nükleik asit alınımı kandaki ürik asit miktarını arttırıp artrit,gut,böbrek taşı hastalıklarına yol açmaktadır.Bu rahatsızlıklara yol açması nedeniyle ürünün hayvan yemlerinde kullanılması daha uygundur.Yem mayaları genellikle kuru maya denilen inaktif hücrelerdir.Bu hücreler bira yapımında arta kalanlar veya kağıt hamuru artıkları,melas,peynir altı suyu gibi karbohidratça zengin değişik büyüme ortamlarında üretilerek ortamdan ayrılırlar.Amerikada yemlere ilave edilen türler Saccharomyces cerevisiae,S.uvarum,Kluyveromyces, Candida utilistir.Avrupada ise peynir altı suyunda üretilmiş S.lactis kullanılmaktadır.(Oura 1982)
3.TEK HÜCRE PROTEİNİ ÜRETİMİNDE KULLANILAN KARBON VE ENERJİ KAYNAKLARI
Temelde tüm mikroorganizmalar karbon, azot, fosfor ve minarelerle bazı vitaminlere ihtiyaç gösterirler.Büyüme ortamlarında mikroorganizmalara karbon ve enerji kaynağı oluşturan maddeye substrat denir.
Mikrobiyal protein üretimi için gerekli substratlar, organizmanın enzimleri tarafından kullanılabilen şekerler veya nişastalar materyallerden karbohidratlardır.Şekil 1de tek hücre proteini için kullanılan substratlar şematik olarak gösterilmiştir.Substrat seçiminde dikkat edilmesi gereken konular: kullanılabilir karbohidrat ve diğer karbon kaynaklarını yeterli oranda içermesi üretim hacmi ve üretimin mevsimlere göre dağılımı, ekonomik olması, toplama-taşıma-saklama işlemlerinin kolay olmasıdır.
Bu substratlar genelde artık maddeler olup iki bölümde incelenebilir.
1-Endüstriyel artıklar
2-Tarımsal artıklar
3.1 Endüstriyel artıklar
Birçok bakteri, küf, maya türleri, karbon ve enerji kaynağı olarak hidrokarbonları kullanabilmektedir.
Hidrokarbonlardan sentetik yol ile elde edilen etanol ve metanol önemli substratlardır.Bu iki alkol suda kolayca çözünmeleri, saf olmaları, biyomasdan kolaylıkla ayrılabilmeleri, patlayıcı özellikte olmamaları açısından avantajlıdır.Bu iki alkolden başka gazyağı n-parafin fraksiyonları metan-sülfit sıvısı önemli karbon kaynaklarıdır.Yapılan araştırmalarda özellikle sülfit sıvısının bir tonundan 13 gr kurumaya elde edildiği saptanmıştır.Fransada B.P. tarafından kurulmuş ve faaliyeti 1976da durdurulan tesiste gazyağı üzerinde Candida tropicalis ve C.lipolytica mayaları üretilmiş, İngilterede B.P. tarafından kurulan tesiste C.lilityca parafin substratı üzerinde üretilmektedir.
3.2 Tarımsal artıklar
1-Hububat samanları, şeker kamışı, şeker pancarı küspeleri, kepek, zeytin prinası gibi nem oranı düşük katı artıklar.
2-Meyve sebze artıkları, konserve artıkları, meyve suyu ve konsantreleri artıkları, narenciye artıkları gibi katı ve yarı katı maddeler.
3-Şeker pancarı ve şeker kamışı melası, zeytin kara suyu,peynir altı suyu,soya ve mısır ıslatma suyu,nişastalı artıklar,turunçgil melası gibi sıvı artıklar.
3.2.1 Başlıca tarımsal artıklar
Vinas: Vinas,alkol fabrikalarının bir artığıdır.Kuru üzüm veya incir,alkol üretiminde kullanıldıktan sonra geriye kalan küspeye denir.Özelliği mikrobiyolojik yolla değerlendirildikten sonra zengin bir protein kaynağına dönüşmesidir.
Melas:Şeker sanayinin bir artığıdır.Bu artık materyal %50 şeker, %10 protein içerir.Mikroorganizma üretimi için uygun bir substrattır.
Zeytin Kara Suyu:Zeytin yağı alınmak üzere işlendikten sonra geriye kalan kara veya kahverengi sıvıya zeytin kara suyu denir.Bu artık materyalle Öcal,Aran ve Çelikkol(1997) de yaptıkları çalışmada %16-43 protein içerikli bir tek hücre proteini elde etmişlerdir.
Peynir Altı Suyu:Peynir yapımı sonucu arta kalan yeşilimsi sarı renkte bir sıvıdır.Peynir yapımı sırasında her kg peynir için ortalama 9 kg peynir altı suyu oluşmaktadır.
Peynir altı suyu,içerik bakımından oldukça zengin bir maddedir.
Çizelge 1. Peynir Altı Suyunun Bileşimi
Şeker % 5
Tuz % 7.5
Total karbohidrat % 5
Protein % 0.83
Yağ % 0.3
Kül % 0.3
Riboflavin 0.1 mg/100 ml
Niasin 0.1 mg/100 ml
Demir 0.12 mg/100 ml
Sodyum 14.5 mg/100 ml
Potasyum 30 mg/100 ml
Kalsiyum 13.5 mg/100 ml
Su % 92
Ph 5.5
4. TEK HÜCRE PROTEİNİ ÜRETİMİNDE KULLANILAN MİKROORGANİZMALAR
Tek hücreli canlılar az miktarda besin içeren ortamlarda üreme yeteneğine sahiptir. Bu nedenle üretimlerinde çok çeşitli ucuz karbon kaynakları kullanılabilmekte ve artık maddeler bu yolla değerlendirilebilmektedir. Ayrıca diğer canlılara göre ağırlıklarını çok kısa sürede iki katına çıkarabilirler. Örneğin;ağırlıklarını iki katına çıkarma süresi bakteri ve mayalar için 20-120 dakika Küf ve algler için 2-6 saat arasındadır. (Soner ,1981)
Protein sentezleri diğer canlılara göre hızlı olup;bakteriler %50-80, mayalar %40-50 , küfler %20-50 ,algler %30-60 arasında protein içermektedirler. Mikroorganizmaların üretimlerindeki diğer bir avantaj da üretim faktörlerinin sürekli kontrol altında tutulabilmesi ve mevsimsel, çevresel faktörlerden etkilenmemesidir.
Mikrobiyal protein üretiminde mikroorganizmada aranan özellikler şunlardır:
Teknik Özellikler:
1-Hızlı üreme yeteneği
2-Basit ortamlarda üreyebilmesi
3-Kültür ortamında homojen dağılımı
4-Kültür ortamından kolayca alınabilmesi
5-Kontaminasyon sorununun olmaması
6-Enerji kaynaklarının yeterli derecede kullanılabilmesi
7-Geniş Ph aralıklarında üreyebilmesi
Fizyolojik özellikler:
1-Toksik olmaması
2-İyi lezzette olması
3-Kolay sindirilebilmesi
4-Besin değerinin ve protein içeriğinin yüksek olması
5.ÖZDEKLER VE YÖNTEMLER
5.1.Özdekler
5.1.1 Kullanılan organizma
Organizma olarak Ascomycetes sınıfından Endomycetales ordosundan Saccharomycetaceae familyasından Saccharomyces cerevisiae kullanıldı.Bu maya endüstride maya,bira,şarap gibi fermente alkollü içkilerin üretiminde ve fırıncılıkta kullanılmaktadır.
Stok kültür ortamı olarak Yeast Malt agar kullanılmıştır.
5.1.2 Kullanılan substrat
Substrat olarak peynir altı suyu kullanılmıştır.Peynir altı suyunun bileşimi üretilen peynirin cinsine,kullanılan sütün niteliğine ve uygulanan üretim yöntemlerine göre değişiklik göstermektedir.Bu yüzden,denemede kullanılan peynir altı suyunun sürekli aynı fabrikadan sağlanması gerekir.
5.1.3 Besiyerleri
Besiyeri 1 Yeast Malt Agar (YMA)
Malt ekstrakt 10 gr
Maya ekstraktı 4 gr
Glukoz 4 gr
Agar 20 gr
Distile su 1000 ml
0.4 N KOH ve 1 N H2SO4 ile Ph=7.2ye ayarlanarak otoklavda 121 0Cde 1.1 atm basınçta 15 dakika süre ile sterilize edilir.
Besiyeri 2 Laktozlu Yeast Malt Broth
Malt ekstrakt 10 gr
Maya ekstraktı 4 gr
Laktoz 4 gr
Fenol red 0.018 gr
Distile su 1000 ml
Ph 7.2
Fenol red indikatörü laktozun parçalanmasıyla kırmızıdan sarıya renk değişimi göstermektedir.
Besiyeri 3 Temel Üretim Ortamı
Peynir altı suyu 100 ml
(NH4)2SO4 0.45 gr
KH2PO4 0.1 gr
Ph 5.5
5.1.4 Mineral Madde Solusyonu
CuSO45H2O 0.005 gr
MgSO47H2O 10 gr
MnSO4H2O 0.5 gr
ZnSO47H2O 0.316 gr
FeCl36H2O 0.05 gr
NaCl 29 gr
CaCl2 0.2 gr
5.2 Yöntemler
5.2.1 Substrata Uygulanan Ön İşlem
Peynir altı suyu hiçbir işleme tabi tutulmadan önce oldukça bulanık ve tortulu bir sıvıdır. İçinde büyük partiküller halinde peynir kalıntıları ihtiva eder. Peynir altı suyunu bu kalıntılardan arındırmak için 1.1 atm basınçta 121 oC de 15 dk. süreyle otoklavlanmış daha sonra diatom toprağından vakumla geçirilerek berraklaştırılmıştır. Böylece elde edilen peynir altı suyu otoklavda sterilize edilerek saklanmıştır.
5.2.2 İnokulum Hazırlanması
100 mllik erlen kaplarına 20 ml peynir altı suyu konmuş ve Ph sı 1 N NaOH, 1N HCL ile 5.5 e ayarlanmıştır .Daha sonra bu ortam otoklavda 121 oC de 1.1 atm basınçta 15 dk tutularak sterilize edilmiştr. Bu şekilde hazırlanan peynir altı suyuna stok besiyerinde (Y.M.A..) üretilen Saccharomyces cerevisiae inokule edilmiş , inokulum ortamları 30oC, hızı 150 devir/dk olan çalkalamalı su banyosunda 72 saat inkübasyona bırakılmıştır. Bu süre sonunda erlen kapları alınarak toplam ve canlı mikroorganizma sayımı yapılmıştır.
5.2.3 Mikrobial Protein Üretme İşlemi
500 ml lik erlenlere 100 ml temel üretim ortamı (Besiyeri 3) konarak, ortam Ph sı 1 N NaOH ,1N HCL ile 5.5 e ayarlanmış ,otoklavda 1.1 atm basınçta , 121oC kültür süspansiyonundan bu ortama %1 oranında aşılama yapılmış ;yine sıcaklığı 30oC ,hızı 150 devir/dk olan çalkalamalı su banyosunda 72 saat inkübe edilmiştir.
5.2.4 Üreme Sonunda Uygulanan İşlem
72 saat devam eden üremeden sonra,erlen çalkalayıcıdan çıkarılmış ve kaplardaki sıvı santrifüj edilmiştir.Santrifüj sonucu çöken canlı hücreler toplanarak kurutulmuştur.Kurutulmuş ürün tartılarak gr olarak miktarı saptanmıştır.Oluşan ürünün protein içeriği Gerrhardt protein tayin cihazı ile Kjendahl yöntemiyle saptanmıştır.Bu yöntemde önce toplam azot miktarı bulunmuş ve bu değer 6.25 faktörü ile çarpılarak % protein miktarı elde edilmiştir.
6. BULGULAR
6.1 Farklı İnokulum Miktarlarının Verime Etkisi
Farklı İnokulum miktarlarının verim üzerine etkisini incelemek amacıyla 5.2.2 bölümünde anlatıldığı gibi İnokulum ortamı hazırlandıktan sonra temel üretim ortamına (Besiyeri 3) %1,%2,%3lük oranlarda aşılama yapılmış,en uygun miktarının %1 olduğu bulunmuştur.Bu oranda aşılama yapıldığında ortalama 135.106 canlı hücre verilmektedir.
6.2 Farklı Organik Ve İnorganik Azot Kaynaklarının Verime Etkisi
Farklı organik ve inorganik azot kaynaklarının verime etkisini incelemek için 5.2.2 ve 5.2.3 bölümünde anlatılan yöntemler uygulanmış sadece değişik azot kaynakları kullanılmıştır.Azot kaynakları yine %0.45 oranında ilave edilmiştir.İnorganik azot kaynakları (NH4)2SO4 ,(NH3)3PO4 ,NH4NO3 ,NH4Cl organik azot kaynakları üre ve C.S.L.dür.En iyi sonuç (NH4)2SO2 ilavesiyle elde edilmiştir.
6.3 Ortama Eklenen Farklı Nutrientlerin Verim Üzerine Etkisi
Temel üretim ortamına(Besiyeri 3) mayaların üreme ortamına eklenen Yeast extrakt , pepton, mineral madde solusyonu ve bunların kombinasyonu denenmiştir.En iyi verim Yeast extrakt ilavesi ile elde edilmiştir.
6.4 Farklı Ph Derecelerinin Verime Etkisi
Bu inceleme için 5.2.2 ve 5.2.3. bölümündeki yömtem uygulanmıştır. Besi yeri Ph ları 1N NaOH ve 1N HCl Ph metrede 4.5 , 5 , 5.5 ,6 olarak ayarlanmıştır. En iyi verim Ph 5.5 te elde edilmiştir.
6.5 Farklı İnkübasyon Sıcaklıklarının Verime Etkisi
Farklı sıcaklıkların verime etkisini incelerken yine 5.2.2 ve 5.2.3. bölümündeki yöntemler kullanılmıştır.Farklı inkübasyon sıcaklıkları olarak,25,30,350Cler şeklinde geniş sıcaklık aralıkları denenmiş ve uygun sıcaklığın 300C olduğu bulunmuştur.
6.6 Mikrobiyal Proteinin Total Protein İçeriği
Üretilen mikrobiyal biyomasın total protein içeriği 5.2.4 bölümünde anlatıldığı gibi saptanmış ve total azot miktarına göre %34.8 olarak bulunmuştur.
7. KAYNAKÇA
ÖZCAN,N.H., 1999 Saccharomyces cerevisiae ile tek hücre proteini üretimi
AKBULUT,N.,1983 Tek hücre proteini . E.Ü. Ziraat Fakültesi Fermentasyon Teknolojisi
ÖCAL,Ş, 1977 . Zeytin kara suyu ve peynir suyundan Mikrobial protein elde edilmesi
BAYAR,N.,1997. Saccharomyces cerevisiae ile tek hücre proteini üretimi
TÜBİTAK, Beslenme ve Gıda Ünitesi Yayınları, No:26
1989, 3. ve 4. Sınıf Mikrobiyoloji Laboratuvar Kılavuzu
Kategori: Biyoloji