Gıda Mikrobiyolojisi Laboratuvarı

12 Temmuz 2007



GIDA MİKROBİYOLOJİSİ LABORATUVARI

DENEY RAPORU-3

MİKROORGANİZMALARIN EKİM YÖNTEMLERİ

(YAYMA PLAK,DÖKME PLAK,SÜRME )

MİKROORGANİZMALARIN BOYAMA YÖNTEMLERİ

(ENDOSPOR BOYAMA,KÜF BOYAMA)

ÖZET

Bu deneyde saf kültür elde etmek amaçlanmıştır.Dökme plak yöntemi,yayma plak yöntemi ve sürme ekim yöntemleriyle izolasyon sağlanır.Plate Count Agar ve Malt Extract Agar besiyerlerine yayma plak yöntemi kullanılarak kıyma örneğinin uygun dilüsyonları ekilecektir.Violet Red Bile Glucose Agar besiyerine dökme plak yöntemi uygulanarak ekim yapılacaktır.Nutrient Agar besiyerine de sürme ekim yapılacaktır.İnkübasyon sonunda, NA besiyerinde gelişen bakterilere endospor boyama yapılacaktır.MEA besiyerinde gelişen küflere de küf boyama yapılacaktır. NA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak yapılan endospor boyama sonucunda mikroskopta Lactobaciller gözlenmiştir. MEA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak yapılan küf boyama sonucunda Penicillium cinsi küfler gözlenmiştir.

GİRİŞ

Üzerinde veya içinde mikroorganizma üretilmiş (ya da üremiş) besiyerlerine kültür denir.Saf kültür, besiyerinde yalnızca tek bir mikroorganizma türü üretilmiş kültürlerdir.Saf kültür elde etmenin bazı aşamaları vardır.Öncelikle örnek alnır.Bu örneğin istenen dilüsyonları hazırlanır.Sonra örnek uygun araçlarla (pipet,öze) besiyerine aktarılır.İnokülasyon işlemi gerçekleştirilir.İnkübasyondan sonra, kültür hazırdır. Dökme plak yöntemi,yayma plak yöntemi ve sürme ekim yöntemleriyle izolasyon sağlanır.

Sporlu bakterileri görüntülemek için endospor boyama yapılır.Bazı bakteriler (Bacillus ve Clostridium cinsi) yüksek sıcaklık,düşük su aktivitesi gibi dış ortam koşullarına dayanıklı sporlar oluştururlar.Bakteri hücresinin içinde oluşan bu spora endospor denir.Sporların soğuk,sıcak,UV,düşük su aktivitesi gibi fiziksel etkenlere pek çok boya maddesine ve kimyasal maddelere karşı vejetatif hücrelerden daha dayanıklı olması kimyasal ve fiziksel yapılarının farklılığından ileri gelir.Gram boyamada kullanılan boyalar spor çeperine nüfuz edemediklerinden gram boyama yöntemiyle sporlar boyanamaz.Sporların görünmesi için en yaygın yöntem Schaffer-Fulton yöntemidir.Preparat hazırlandıktan sonra malachite yeşili boyası uygulanır,boyanın spor çeperine nüfus edebilmesi için preparat bir süre ısıtılır.Boya yıkanıp,safranin karşıt boyası ile boyanır.Mikroskopta sporlar yeşil,hücre pembe-kırmızı görülür (Temiz, 2000).

Küf boyamada küflerin misel ve spor yapılarının mikroskopta görüntülenmesi için yapılır.Lama önce boya çözeltisi konur,üzerine bir miktar agarla birlikte alınan küf miselleri yerleştirilir,lamel kapatılarak mikroskopta incelenir.

Gıda sanayiinde boyama yöntemlerinden yararlanarak mikroorganizmaların morfolojik özellikleri belirlenir.Böylece hangi tip mikroorganizma oldukları anlaşılır.Buna göre,mikroorganizma gelişimini önleyici tedbirler alınır.

MATERYAL VE METOT

Dilüsyon hazırlanması

Materyal

-Kıyma örneği

-Fizyolojik Tuz Çözeltisi

-Mekanik çalkalayıcı

-Pipet

-Deney tüpleri

-Pens

Uygulama

Gıda maddesinden(kıyma) steril pens ve bistüri yardımıyla steril petri kutusuna 10±0.4g tartılır.

Kıyma ve bir erlen içerisinde önceden otoklavda steril edilmiş 90 ml fizyolojik tuz çözeltisi,mekanik çalkalayıcıya konur.Mekanik çalkalayıcı cihazında 5 dak,250 devirde homojenize edilir.Böylece örnek 1:10 oranında seyreltilmiş olur (Şekil 1).

Homojenizasyonu tamamlanmış gıda maddesinden steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak içerisinde 9 ml dilüsyon sıvısı bulunan tüpe ilave edilir.Böylece örnek 1:100 oranıda seyreltilmiş olur.

10-2 dilüsyonundan steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak, içerisinde 9 ml steril fizyolojik tuz çözeltisi bulunan bir diğer tüpe ilave edilir.Örnek 1:1000 oranında seyreltilmiş olur.

10-3 dilüsyonundan steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak, içerisinde 9 ml steril fizyolojik tuz çözeltisi bulunan bir diğer tüpe ilave edilir.Örnek 1:10000 oranında seyreltilmiş olur.

10-4 dilüsyonundan steril bir pipet yardımıyla 1 ml alınarak, içerisinde 9 ml steril fizyolojik tuz çözeltisi bulunan bir diğer tüpe ilave edilir.Örnek 1:100000 oranında seyreltilmiş olur.

Böylelikle,kıyma örneğinin 10-2 , 10-3, 10-4,10-5 dilüsyonları ekim için hazırdır.

Yayma Plak Yöntemi ile Ekim Yapılması

Materyal

-Kıyma örneği dilüsyonları

-Katı besiyerleri (PCA ve MEA)

-Pipet

-Drigalski

-Bunzen Beki

-Tüp karıştırıcı

-İnkübatör

Uygulama

Yayma plak yöntemiyle, PCA besiyerine kıyma örneğinin 10-3, 10-4,10-5 dilüsyonları ekilir.PCA besiyeri genel amaçlı bir besiyeridir.

10-5 dilüsyonu içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karıştırılarak homojenize edilir.Bek alevi yanında steril bir pipetle 10-5 dilüsyonundan alınarak, içerisinde PCA katı besiyeri bulunan petri kutusuna 0.1 ml ekilir.Petri kutusunun üzerine 10-6 yazılır.Sonra 10-4 dilüsyonundan aynı şekilde bir diğer petri kutusuna ekim yapılır.Petri kutusu üzerine 10-5 yazılır.Daha sonra, 10-3 dilüsyonundan ekim yapılır.Petri kutusuna 10-4 yazılır.

Drigalski adı verilen steril bir cam baget vasıtasıyla ekilen kısım (inokulum) petri yüzeyine yayılır.Ancak drigalski kullanımından önce alkole daldırılıp,bunzen beki alevinden geçirilmelidir.Böyle bir yol izlendiğinde, drigalski ekim öncesinde besiyerinin boş kısmına değdirilerek soğutulmalıdır.

PCA besiyerlerini içeren petri kutuları ters çevrilerek inkübatöre konur.PCA için 35-37 °C de 48 saat yeterlidir.

Yayma plak yöntemiyle, MEA besiyerine kıyma örneğinin 10-1 ve 10-2 dilüsyonları ekilir.MEA maya ve küflerin teşhisi,izolasyonu ve sayımlarında yararlanılan bir besiyeridir.

10-2 dilüsyonu içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karıştırılarak homojenize edilir.Bek alevi yanında steril bir pipetle 10-2 dilüsyonundan alınarak içerisinde MEA katı besiyeri bulunan petri kutusuna 0.1 ml ekilir.Petri kutusunun üzerine 10-3 yazılır.Sonra 10-1 dilüsyonundan aynı şekilde bir diğer petri kutusuna ekim yapılır.Petri kutusu üzerine 10-2 yazılır.

Drigalski adı verilen steril bir cam baget vasıtasıyla ekilen kısım (inokulum) petri yüzeyine yayılır.

MEA besiyeri düz bir şekilde inkübatöre konur.MEA maya ve küfler için genel bir besiyeridir.Mayalar için, 25 °C de 3 gün,küfler için 25 °C de 2 gün inkübe edilir.

Dökme Plak Yöntemi

Materyal

-Kıyma örneği dilüsyonları

-Katı besiyeri (VRBGA)

-Pipet

-Tüp karıştırıcı

-Bunzen Beki

-İnkübatör

Uygulama

Dökme plak (pour plate) yönteminde,steril,boş petri kutusuna önce ekim yapılıp,üzerine yaklaşık 45° C ye kadar soğutulmuş besi yeri dökülür. Kıyma örneğinin 10-3, 10-4,10-5 dilüsyonları VRBGA besiyeri için ekilecektir. VRBGA koliform ve Enterobacteriacea tanımlaması için kullanılan bir besiyeridir.

Ekim işlemine en son dilüsyondan başlanır.10-5 dilüsyonu içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karştırılarak homojenize edilir.Bek alevi yanında steril bir pipetle 1 ml alınarak petri kutusuna ilave edilir.Petri kutusu üzerine dilüsyon ile aynı seyreltme oranı yazılmalıdır. 10-3 ve 10-4 dilüsyonlardan da benzer şekilde ekim yapılarak, işlem tamamlanır (Şekil 2).

Yaklaşık 45 °C ye soğultulmuş VRBGA besiyeri petri kutusuna ilave edilir.Petri kutusu inokulum ile besiyeri karışımının sağlanması için sekiz çizerek yavaşça karıştırılır. Karıştırma sırasında petri kutusu kapağına bulaşma olmamasına ve agarın petri kutusundan taşmamasına dikkat edilmelidir.

Petri kutuları ters çevrilerek inkübatöre konur.VRBGA besiyeri için, 37 °C de 24-48 saat inkübe edilir.

NA Besiyerine Sürme Ekim Yapılması

Materyal

-Öze

-Katı veya sıvı besiyerinde 24 saatlik taze bakteri kültürü

-Tüp karıştırıcı

Uygulama

Sürme ekim yöntemi öze kullanılarak gerçekleştirilir.Bu yöntem tek koloni düşürme tekniği olarak da anılmaktadır.

Sıvı besiyerinden Öze ile Ekim

Sıvı besiyerini (kıyma örneği) içeren deney tüpü bir tüp karıştırıcıda karıştırılır.Böylece, sıvı besiyerindeki mikroorganizmaların bulundukları sıvı içinde homojen dağılımı sağlanır.

Öze sağ elde kalem gibi tutularak uç kısmı Bunzen beki alevinin mavi kısmına daldırılır ve öze dike yakın bir konuma getirilir.10-15 saniye özenin soğuması için beklenir.

Sol elde bulunan tüpün ağzındaki pamuk tıkaç,öze tutulan elin parmaklarıyla tüp hafifçe ekseni etrafında çevrilerek açılır.

Tüpün ağız kısmı alevden geçirilir ve tüp hafif eğilerek öze ucu sıvı besiyerine daldırılır.Bir öze dolusu örnek alınır.

Steril agarlı besiyerini (NA) içeren petri kutusu sol elin ayası içine alınır. İşaret parmağı destek vazifesi görürken,baş parmak aracılığıyla kapak aralanır.Öze bu aralıktan içeri sokularak,öze ucunun örnek alınan kısmı agar yüzeyinin seçilecek bir bölgesine temas ettirilir.Örnek bu bölgede hafifçe ezilerek birkaç mm çapında yayılır.Öze ile bu yayılma alanından başlayarak sürme işlemine geçilir (Şekil 3).

Katı Besiyerinden Öze ile Ekim

Öze sağ elde kalem gibi tutularak uç kısmı Bunzen beki alevinin mavi kısmına daldırılır ve öze dike yakın bir konuma getirilir.

PCA besiyerini içeren petri kutusunun kapağı alevin yanında aralanır ve öze bu aralıktan içeri sokularak,besiyerinin boş bir alanında soğutulur.

Steril özenin ucu PCA besiyerindeki üreme bölgesine veya koloniye hafifçe temas ettirilerek ya da sürülerek örnek alınır.

Steril agarlı besiyerini (NA) içeren petri kutusu sol elin ayası içine alınır. İşaret parmağı destek vazifesi görürken,baş parmak aracılığıyla kapak aralanır.Öze bu aralıktan içeri sokularak,öze ucunun örnek alınan kısmı agar yüzeyinin seçilecek bir bölgesine temas ettirilir.Örnek bu bölgede hafifçe ezilerek birkaç mm çapında yayılır.Öze ile bu yayılma alanından başlayarak sürme işlemine geçilir (Temiz, 2000).

Endospor Boyama

Materyal

-Lam

-Öze

-Katı veya sıvı besiyerinde 24 saatlik taze bakteri kültürü

-Boya çözeltileri; Malachite yeşili,safranin

-% 95′ lik etil alkol

-Kurutma kağıdı

-İmmersiyon yağı

-Mikroskop(100X obj.)

Malachite Yeşili

Malachite green 5g

Distile su 100ml

Safranin

Safranin 0.5g

Distile su 100ml

Uygulama

Preparat hazırlanması

Lam steril bir pensle tutulup alkole daldırılır,sonra aleve tutulur.Mikroorganizmalar uzaklaştırılmış olur.

Lam üzerine öze ile bir damla steril fizyolojik tuz çözeltisi damlatılır.

Öze bek alevinde sterilize edilir,soğuması için beklenir.

Steril öze ile katı besiyerinden (NA, 10-3 katı besiyerinden ) bir miktar kültür alınır.

Kültür lam üzerine damlatılmış su ile karıştırılır.

Preparatın kuruması için bir süre beklenir.

Bir steril pensle bir ucundan tutulan lam bunzen alevinden 20 kez geçirilir.Böylece mikroorganizma lam üzerine tespit (fiksasyon) edilmiş olur.

Boyama

Preparatın üzeri kurutma kağıdı ile kaplanır,üzerine malachite yeşili çözeltisi dökülür.

Preparat hafif alev üzerinde 5 dakika ısıtılır.Ancak preparat kurutulmamalıdır.Gerekirse üzerine boya ilave edilmelidir.

Preparat musluk suyu ile 10 saniye yıkanır.

Karşıt boyama için safraninle 15 saniye boyanır.

Su ile yıkanır,kurutma kağıdıyla kurutulur.

İmmersiyon yağı damlatılarak (100X) objektifle incelenir.

Küf Boyama

Materyal

-Lam

-Öze

-Katı veya sıvı besiyerinde 24 saatlik taze bakteri kültürü

-Boya çözeltileri; laktofenol

-% 95′ lik etil alkol

-Kurutma kağıdı

-İmmersiyon yağı

-Mikroskop(100X obj.)

-Lamel

Küf Boyama İçin Laktofenol Çözeltisi

Laktik asit 20g (16ml)

Gliserol 40g (31ml)

Fenol kristalleri 20g

Anili blue 0.05g

Distile su 20 ml

Uygulama

Lam üzerine 1 damla laktofenol damlatılır.

Öze alevde kor haline getirilir,agarın (MEA,10-3) kenarında soğutulur.Ucu yuvarlak ve yumuşak öze yerine sert,düz öze kullanılmalıdır.

Öze yardımıyla koloninin kenarından,bir parça agar ile birlikte kültür alınır.Bunun nedeni; küfün asıl yapısının agara nüfus etmiş olmasıdır.

Boya çözeltisinin üzerine konur.

Üzerine 1 damla alkol damlatılır.

Kültürün üzeri arada hava kalmayacak şekilde kapatılır.Eğer hava kabarcığı varsa bir özenin sapıyla lamel üzerine hafifçe bastırılarak bu kabarcık giderilmeye çalışılır.

Önce (10x) objektif,sonra (40x) objektif ve en son yağ damlatılarak (100x) objektifle incelenir.

Pratik Yol

Lam üzerine 1 damla laktofenol damlatılır.

Bir bantla küf agardan alınır.

Lamın üzerine yapıştırılır.

Mikroskopta incelenir.

BULGULAR VE TARTIŞMA

Violet Red Bile Glucose Agar besiyeri ile yapılan dökme plak yöntemiyle ekim sonucunda koliform bakteriler yerine küf gelişimi gözlenmiştir.Bu küfler havadan besiyerine bulaşmıştır.

Malt Extract Agar besiyerine yapılan yayma plak yöntemiyle ekim sonucunda maya ve küf gelişimi gözlenmiştir.Ancak, koloniler çok yoğun olduğu için sayım yapılamamıştır.

Plate Count Agar besiyerine yapılan yayma plak yöntemiyle ekim sonuçları:

M.o. sayısı (cfu-g)=petrideki Mo sayısıxseyreltme faktörü*/petri kutusuna ekilen miktar(ml)

Seyreltme faktörü=1/seyreltme oranı

PCA (10-5 ) deki koloni sayısı=8

PCA (10-5 ) deki koloni sayısı=10

PCA (10-4 ) deki koloni sayısı=9

PCA (10-4 ) deki koloni sayısı=19

Koloni sayıları 25 koloniden az olduğu için sayım yapılamaz.

Nutrient Agar besiyerlerine sıvı besiyerinden ve katı besiyerinden yapılan öze ile ekim işlemleri sonucunda besiyerlerinde bakteri,maya ve küf gelişimi gözlenmiştir.

NA 10-3 katı besiyerinden bir miktar kültür alınarak yapılan endospor boyama sonucunda mikroskopta (100x objektif) uzun çubuk şeklinde sporlu bakteriler (Lactobaciller) gözlenmiştir.Bakterilerin sporları yeşil,vejetatif hücreleri ise pembe-kırmızı renkte görünmektedir(Şekil 4).

MEA 10-3 katı besiyerinden bir miktar kültür alınarak yapılan küf boyama sonuçları, önce (10x) objektif, sonra (40x) objektif ve en son yağ damlatılarak (100x) objektifle incelenmiştir.Sonuçta Penicillium cinsi küfler gözlenmiştir (Şekil 5).

SONUÇLAR

Dilüsyon yöntemiyle, kıymadaki canlı mikroorganizma sayısı belirlenmiştir. Örneğin uygun seri dilüsyonları hazırlanarak uygun agarlı besiyerlerine ekimleri gerçekleştirilmiştir.Yayma plak yöntemiyle Plate Count Agar ve Malt Extract Agar;dökme plak yöntemiyle de Violet Red Bile Glucose Agar besiyerlerine ekimler yapılmıştır.İnkübasyon sonucunda koloniler sayılmıştır.Nutrient Agar besiyerlerine, sıvı besiyerinden öze ile ve katı besiyerinden (PCA) öze ile sürme ekim yapılmıştır.Yapılan izolasyon sonucundan kısmen izole koloniler elde edilmiştir. NA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak endospor boyama yapılmıştır.Mikroskopta Lactobaciller gözlenmiştir. MEA 10-3 katı besiyerinden izole bir mikroorganizma alınarak küf boyama yapılmış ve Penicillium cinsi küfler gözlenmiştir.

REFERANSLAR

HARRIGAN, W.F.1998.”Laboratory Methods in Food Microbiology.”3rd ed.Academic Press,New York.

TEMİZ,AYHAN.2000.”Genel Mikrobiyoloji Uygulama Teknikleri”.3rd ed.Hatiboğlu Yayınevi,Ankara.

DART,R.K.1996.”Microbiology For Analytical Chemist”.3rd ed.Redwood Books Ltd,Cambridge.

Kategori: Biyoloji


Rasgele...


Destekliyoruz arkada - arkadas - partner - partner - arkada - proxy - yemek tarifi - powermta - powermta administrator - Proxy